長序三寶木枝葉乙醇提取物二氯甲烷部分的化學(xué)成分

楊長水， 楊 超， 姜厚禮， 冒浩羽， 董小耘，2，①

〔1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)， 江蘇 揚(yáng)州 225009； 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室， 江蘇 揚(yáng)州 225009〕

長序三寶木(TrigonostemonhowiiMerr. et Chun)隸屬于大戟科(Euphorbiaceae)三寶木屬(TrigonostemonBlume)，為中國海南的特有植物[1]。三寶木屬植物是在中國和泰國廣泛應(yīng)用的民族民間藥，大多具有防腐、殺菌、止瀉、化痰的功效[2-4]。三寶木屬植物主要含有瑞香烷型二萜[5]和生物堿類[6]等化學(xué)成分，并含有一些三萜類成分[7]和一系列香豆素類成分[8]。相關(guān)研究結(jié)果表明：長序三寶木中含有二萜和四氫呋喃衍生物等化學(xué)成分，具有抗腫瘤和抗艾滋病病毒(HIV)等生物活性[9，10]，可見，長序三寶木是具有潛在開發(fā)價值并有待深入研究的藥用植物。

為進(jìn)一步明確長序三寶木中的活性成分結(jié)構(gòu)與功能，作者對長序三寶木枝葉95%乙醇提取物的二氯甲烷部分的組成成分進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為長序三寶木藥用活性成分的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試長序三寶木的完整葉片及多年生和當(dāng)年生枝條均于2019年3月采集自海南省陵水縣，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李海濤副研究員鑒定。葉片和枝條在自然條件下晾干后混勻并粉碎，備用。

主要儀器：LC3000型半制備高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，AVANCE 600 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)，maXis超高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)，DHG-9246A型電熱干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

主要試劑：柱色譜硅膠(100～200目)(青島海洋化工有限公司)，小孔吸附樹脂(MCI，GEL CHP20P，75～150 μm，北京元寶山色譜科技有限公司)，凝膠過濾樹脂(Sephadex LH-20，美國GE公司)，二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇等普通試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

取22 kg樣品，加入140 L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流提取3次，每次提取3 h；合并提取液，回收溶劑后得到乙醇總浸膏1 667 g；加入10 L蒸餾水混懸后，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各4 L萃取，各萃取4次，合并各萃取液并回收溶劑，分別得到二氯甲烷部分浸膏196.3 g、乙酸乙酯部分浸膏130.2 g和正丁醇部分浸膏280.5 g。

二氯甲烷部分浸膏經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比100∶0～0∶100)梯度洗脫，得到11個組分(Fr.1～Fr.11)。Fr.4(20.0 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比50∶1～2∶1)梯度洗脫，再經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶，得到化合物6(26.1 mg)和化合物7(141.5 mg)。Fr.5(11.3 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比50∶1～1∶1)梯度洗脫，得到化合物8(29.6 mg)。Fr.7(5.7 g)用石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比50∶1～1∶1)梯度洗脫，得到7個亞組分(Fr.7-1～ Fr.7-7)，其中，F(xiàn)r.7-5經(jīng)石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比20∶1～1∶1)梯度洗脫，得到化合物9(22.2 mg)。Fr.9(9.8 g)用石油醚-乙酸乙酯溶液(體積比20∶1～0∶1)梯度洗脫，得到4個亞組分(Fr.9-1～Fr.9-4)，其中，F(xiàn)r.9-1用MCI柱以甲醇-水溶液(體積比3∶7～1∶0)梯度洗脫后，再用半制備高效液相色譜柱〔洗脫劑為甲醇-水溶液(體積比50∶50)〕分離，分別得到化合物2(5.0 mg)和化合物5(8.0 mg)；Fr.9-3用MCI柱以甲醇-水溶液(體積比3∶7～1∶0)梯度洗脫后，再用半制備高效液相色譜柱〔洗脫劑為甲醇-水溶液(體積比40∶60)〕分離，分別得到化合物3(1.2 mg)和化合物4(4.2 mg)；Fr.9-4用MCI柱以甲醇-水溶液(體積比3∶7～1∶0)梯度洗脫后，再依次用半制備高效液相色譜柱〔洗脫劑為甲醇-水溶液(體積比83∶17)〕分離和Sephadex LH-20柱以甲醇洗脫純化，得到化合物1(80.2 mg)。

將所得化合物的理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，從而鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

化合物1：白色針晶(甲醇)；HR-ESI-MSm/z：249.073 6 [M+Na]+；分子式C11H14O5。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.33(2H，s，H-2，6)，5.88(1H，s，4-OH)，4.38(2H，q，J=7.2 Hz，H-1′)，3.95(6H，s，3，5-OCH3)，1.41(3H，t，J=7.2 Hz，H-2′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：121.5(C-1)，106.6(C-2，6)，146.6(C-3，5)，139.1(C-4)，166.4(C-7)，60.9(C-1′)，56.4(3，5-OCH3)，14.4(C-2′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故確定化合物1為丁香酸乙酯(ethyl syringate)。

化合物2：白色粉末；HR-ESI-MSm/z：245.078 8 [M+Na]+；分子式C12H14O4。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.62(1H，d，J=10.2 Hz，H-7)，7.07(1H，d，J=5.6 Hz，H-5)，7.03(1H，s，H-2)，6.91(1H，d，J=5.6 Hz，H-6)，6.29(1H，d，J=10.2 Hz，H-8)，5.90(1H，s，4-OH)，4.26(2H，q，J=4.8 Hz，H-1′)，3.92(3H，s，3-OCH3，1.34(3H，t，J=4.8 Hz，H-2′)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：127.0(C-1)，114.7(C-2)，146.7(C-3)，147.9(C-4)，115.6(C-5)，123.0(C-6)，144.7(C-7)，109.3(C-8)，167.3(C-9)，60.4(C-1′)，14.3(C-2′)，55.9(3-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故確定化合物2為阿魏酸乙酯(ethyl ferulate)。

化合物3：黃色固體；HR-ESI-MSm/z：121.029 0 [M-H]-；分子式為C7H6O2。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：9.87(1H，s，7-CHO)，7.81(2H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-2，6)，6.96(2H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-3，5)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：130.2(C-1)，132.4(C-2，6)，116.0(C-3，5)，161.1(C-4)，190.8(7-CHO)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故確定化合物3為對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)。

化合物4：黃色固體；HR-ESI-MSm/z：151.038 6 [M-H]-；分子式為C8H8O3。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：9.82(1H，s，7-CHO)，7.42(2H，m，H-2，6)，7.02(1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，6.17(1H，s，4-OH)，3.96(3H，s，2-OCH3)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：130.0(C-1)，147.2(C-2)，127.6(C-3)，151.7(C-4)，114.4(C-5)，108.8(C-6)，56.2(4-OCH3)，190.9(7-CHO)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故確定化合物4為異香草醛(isovanillin)。

化合物5：白色粉末；HR-ESI-MSm/z：159.041 9 [M+Na]+；分子式為C8H8O2。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.97(1H，s，4-OH)，7.94(2H，dd，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.98(2H，dd，J=8.4 Hz，H-3，5)，2.62(3H，s，H-8)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：129.5(C-1)，131.3(C-2，6)，115.6(C-3，5)，161.5(C-4)，198.9(C-7)，26.3(C-8)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故確定化合物5為對羥基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone)。

化合物6：白色固體；HR-ESI-MSm/z：283.264 3 [M-H]-；分子式為C18H36O2。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：2.36(2H，t，J=7.8 Hz，H-2)，1.64(2H，m，H-3)，1.25(28H，m，H-4～17)，0.88(3H，t，J=6.6 Hz，H-18)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：179.4(C-1)，33.9(C-2)，31.9(C-3)，29.7～29.2(C-4～14)，29.0(C-15)，24.7(C-16)，22.7(C-17)，14.3(C-18)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故確定化合物6為硬脂酸(stearic acid)。

化合物7：白色粉末；HR-ESI-MSm/z：449.376 7 [M+Na]+；分子式為C30H50O。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：0.88(3H，d，J=7.0 Hz，H-23)，0.73(3H，s，H-24)，0.87(3H，s，H-25)，1.01(3H，s，H-26)，1.05(3H，s，H-27)，1.18(3H，s，H-28)，1.00(3H，s，H-29)，0.95(3H，s，H-30)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：22.3(C-1)，42.2(C-2)，213.2(C-3)，59.5(C-4)，41.5(C-5)，41.3(C-6)，18.2(C-7)，53.1(C-8)，37.4(C-9)，58.2(C-10)，35.6(C-11)，30.5(C-12)，38.3(C-13)，39.7(C-14)，32.4(C-15)，36.0(C-16)，30.0(C-17)，42.8(C-18)，35.3(C-19)，28.1(C-20)，32.8(C-21)，39.3(C-22)，6.8(C-23)，14.6(C-24)，18.0(C-25)，20.3(C-26)，18.7(C-27)，32.1(C-28)，35.0(C-29)，31.8(C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故確定化合物7為木栓酮(friedelin)。

化合物8：白色粉末；HR-ESI-MSm/z：463.355 5 [M+Na]+；分子式為C30H48O2。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：0.92(3H，s，H-23)，0.65(3H，s，H-24)，10.18(1H，s，25-CHO)，0.96(3H，s，H-26)，1.05(3H，s，H-27)，1.15(3H，s，H-28)，0.96(3H，s，H-29)，0.96(3H，s，H-30)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：22.8(C-1)，42.8(C-2)，211.7(C-3)，57.1(C-4)，39.0(C-5)，39.4(C-6)，19.7(C-7)，53.1(C-8)，41.0(C-9)，30.2(C-10)，38.5(C-11)，31.2(C-12)，40.3(C-13)，35.2(C-14)，28.9(C-15)，35.7(C-16)，52.5(C-17)，41.6(C-18)，31.3(C-19)，28.2(C-20)，53.4(C-21)，59.0(C-22)，7.3(C-23)，15.9(C-24)，205.0(C-25)，17.2(C-26)，18.5(C-27)，34.9(C-28)，31.6(C-29)，32.7(C-30)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[18]基本一致，故確定化合物8為木栓酮-25-醛(friedelan-3-one-25-al)。

化合物9：白色針晶，與豆甾醇對照品共同進(jìn)行薄層色譜(TLC)分析，在3種溶劑系統(tǒng)中展開，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%硫酸-乙醇顯色，呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)，且其與對照品Rf值完全一致，故鑒定為豆甾醇(stigmasterol)。

上述結(jié)果表明：長序三寶木枝葉乙醇提取物的二氯甲烷部分含有5個小分子芳香族化合物(化合物1～5)、2個三萜類化合物(化合物7和8)、1個脂肪酸類化合物(化合物6)和1個甾醇類化合物(化合物9)。除化合物2和5外，其余化合物均從長序三寶木中首次分離獲得，其中化合物1、3、4、7和8首次從三寶木屬種類中分離獲得。