血清中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)水平與狼瘡性腎炎的相關(guān)性

韓敬，顧津伊，劉裔，秦源，趙玲華

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）為系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）累及腎臟導(dǎo)致的繼發(fā)性免疫性腎小球疾病，是終末期腎病的常見病因，據(jù)統(tǒng)計我國近半數(shù)SLE患者患有LN［1-2］。隨著診療技術(shù)的不斷提高，SLE患者的預(yù)后有了明顯的改善［3］。我國SLE患者的平均發(fā)病年齡為30歲，50~60歲時超過一半患者死亡，其中LN居前期死因的前三位［4］。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細(xì)胞釋放的包含中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、DNA等的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是近年來發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞防御機(jī)體感染的一種新方式，但NETs中也包含多種抗原，NETs生成增多或清除不及時可為自身抗原形成提供基礎(chǔ)，與自身免疫性疾病發(fā)生密切相關(guān)［5］。目前NETs與LN關(guān)系的研究較少，其臨床意義尚不清楚。本研究擬檢測LN患者血清NETs水平，分析其與LN病情以及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月—2021年1月云南大學(xué)附屬醫(yī)院收治的LN患者為LN組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。（2）腎活檢或臨床資料完整。（3）隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等其他自身免疫性疾病。（2）合并急慢性感染、膿毒癥、惡性腫瘤。（3）近期接受免疫抑制劑或激素治療。最終納入LN患者92例，男21例，女71例，年齡22~51歲，平均（38.15±6.35）歲，病理分型［7］：Ⅱ+Ⅴ型28例，Ⅲ+Ⅴ型30例，Ⅳ+Ⅴ型34例。根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度評分（SLEDAI）-2000評估疾病活動度［8］，將患者分為輕度活動組（評分≤6分，31例），中度活動組（評分7~12分，33例）和重度活動組（評分＞12分，28例）。另外，選擇同期收治的97例腎功能和尿常規(guī)正常的SLE患者為SLE組，SLE參照《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》［9］診斷標(biāo)準(zhǔn)，男20例，女77例，年齡26~55歲，平均（38.69±6.42）歲。以83例門診體檢健康志愿者作對照組，男16例，女67例，年齡24~53歲，平均（38.15±6.39）歲。LN組、SLE組、對照組的性別（χ2=0.342）、年齡（F=0.189）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署同意書。

1.2 實驗室指標(biāo)檢測 LN組和SLE組患者入院第2日晨、對照組體檢當(dāng)日晨采集空腹靜脈血和24 h尿液，靜脈血標(biāo)本3 mL置于干燥試管，取凝固后上層液離心（4℃，3 000 r/min，離心15 min，離心半徑10 cm），取血清保存于-20℃超低溫冰箱待檢。采用髓過氧化物酶（MPO）-DNA復(fù)合物捕獲酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測NETs水平，取血清樣本，96孔板每孔加入100μL（1∶50）稀釋的血清，加入抗MPO單克隆抗體（美國Bio-Rad公司），4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入過氧化物酶底物（美國Bio-Rad公司），按照ELISA試劑盒（德國Roche公司）說明書檢測捕獲的MPO-DNA復(fù)合物，使用Mark微孔板吸光度分光光度計（美國Bio-Rad公司）檢測450 nm處的吸光度值。ELISA檢測血清脫氧核糖核酸酶1（DNASE1），取血清樣本，96孔板每孔加入100μL（1∶50）稀釋的血清，抗DNASE1兔多克隆抗體（英國Abcam公司），4℃下孵育過夜，PBS洗滌3次，加入100μL底物溶液并用50μL終止液封閉，使用Mark微孔板吸光度分光光度計（美國Bio-Rad公司）檢測450 nm處的吸光度值，ELISA試劑盒購自美國Bio-Rad公司。取血清樣本，采用美國愛德士Catalyst全自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），采用改良MDRD公式估算腎小球濾過率（eGFR），eGFR=175×（Scr-1.234）×（年齡-0.179）×（0.79女性）［10］。采用鄰苯三酚紅比色法檢測24 h尿蛋白定量。

1.3 LN活動性指數(shù)（AI）和慢性指數(shù)（CI）評分 LN患者入院后當(dāng)日評估腎組織AI和CI評分［11］。AI評分：從毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞增多（無增多計0分，增多＜25%計1分，增多25%~50%計2分，增多＞50%計3分）、中性粒細(xì)胞浸潤（無浸潤計0分，浸潤占比＜25%計1分，浸潤占比25%~50%計2分，浸潤占比＞50%計3分）、中性粒細(xì)胞核碎裂（無核碎裂計0分，核碎裂占比＜25%計1分，核碎裂占比25%~50%計2分，核碎裂占比＞50%計3分）、纖維素樣壞死（無壞死計0分，壞死占比＜25%計1分，壞死占比25%~50%計2分，壞死占比＞50%計3分）、內(nèi)皮下沉積物（無沉積計0分，沉積占比＜25%計1分，沉積占比25%~50%計2分，沉積占比＞50%計3分）、細(xì)胞新月體（有細(xì)胞新月體計0分，細(xì)胞新月體占比＜25%計1分，細(xì)胞新月體占比25%~50%計2分，細(xì)胞新月體占比＞50%計3分）、纖維細(xì)胞新月體（有纖維細(xì)胞新月體計0分，纖維細(xì)胞新月體占比＜25%計1分，纖維細(xì)胞新月體占比25%~50%計2分，纖維細(xì)胞新月體占比＞50%計3分）、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤（無炎細(xì)胞浸潤計0分，炎細(xì)胞浸潤占比＜25%計1分，炎細(xì)胞浸潤占比25%~50%計2分，炎細(xì)胞浸潤占比＞50%計3分）8項進(jìn)行評分，總分0~24分。CI評分：從腎小球硬化（無硬化計0分，硬化占比＜25%計1分，硬化占比25%~50%計2分，硬化占比＞50%計3分）、纖維性新月體（無纖維性新月體計0分，纖維性新月體占比＜25%計1分，纖維性新月體占比25%~50%計2分，纖維性新月體占比＞50%計3分）、間質(zhì)纖維化（無間質(zhì)纖維化計0分，間質(zhì)纖維化占比＜25%計1分，間質(zhì)纖維化占比25%~50%計2分，間質(zhì)纖維化占比＞50%計3分）、腎小管萎縮（無腎小管萎縮計0分，腎小管萎縮占比＜25%計1分，腎小管萎縮占比25%~50%計2分，腎小管萎縮占比＞50%計3分）4項進(jìn)行評分，總分0~12分，得分越高，LN病情越嚴(yán)重。

1.4 隨訪 所有LN患者出院后接受定期電話隨訪（每月1次），隨訪截至2021年5月31日，記錄隨訪期間腎臟相關(guān)終點事件發(fā)生情況，包括Scr較基線翻倍、進(jìn)入終末期腎臟病行腎臟替代治療［12］。根據(jù)隨訪期間腎臟相關(guān)終點事件發(fā)生情況將患者分為預(yù)后不良組（25例）和預(yù)后良好組（67例）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov法檢驗符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（組間多重比較LSD-t法）或獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Pearson法分析NETs與DNASE1、SLEDA1-2000評分、腎組織AI和CI評分、腎功能之間的相關(guān)性。Logistic逐步回歸分析影響LN預(yù)后的因素，受試者工作特征（ROC）曲線分析NETs對LN患者預(yù)后的預(yù)測價值。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組患者NETs、DNASE1及腎功能比較 LN組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量高于對照組和SLE組，血清DNASE1水平、eGFR低于SLE組和對照組（P＜0.05）。SLE組血清NETs水平高于對照組，血清DNASE1水平低于對照組（P＜0.05），BUN、Scr、eGFR、24 h尿蛋白定量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 重度活動組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量、AI評分、CI評分高于中度活動組和輕度活動組（P＜0.05），DNASE1水平、eGFR低于中度活動組和輕度活動組（P＜0.05）。中度活動組血清NETs水平、BUN、Scr、24 h尿蛋白定量、AI評分、CI評分高于輕度活動組（P＜0.05），DNASE1水平、eGFR低于輕度活動組（P＜0.05），見表2。

2.3 NETs與DNASE1、腎功能、SLEDA1-2000評分、腎組織AI和CI評分的相關(guān)性 NETs水平與eGFR（r=-0.536）、DNASE1（r=-0.765）呈 負(fù) 相 關(guān)（P＜0.05），與24 h尿蛋白定量（r=0.695）、SLEDA1-2000評分（r=0.764）、腎組織AI評分（r=0.859）、CI評分（r=0.878）呈正相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 影響LN預(yù)后的因素分析 預(yù)后不良組SLEDA1-2000評分、AI評分、血清NETs水平、24 h尿蛋白定量高于預(yù)后良好組（P＜0.05），血清DNASE1水平、eGFR低于預(yù)后良好組（P＜0.05），見表3。以LN患者預(yù)后（0=預(yù)后良好，1=預(yù)后不良）為因變量，SLEDA1-2000評分、AI評分、NETs為自變量行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果示高AI評分和高NETs為LN預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05），見表4。

Tab.1 Comparison of clinical data between the three groups表1 各組臨床資料比較 （±s）

Tab.1 Comparison of clinical data between the three groups表1 各組臨床資料比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與SLE組比較，P＜0.05。

組別對照組SLE組LN組F n 83 97 92 NETs（μg/L）0.43±0.13 0.65±0.21a 1.02±0.30ab 176.741＊＊DNASE1（μg/L）4.32±1.35 3.75±0.84a 3.02±0.62ab 59.651＊＊BUN（mmol/L）6.12±1.47 6.53±1.62 38.15±9.15ab 995.797＊＊Scr（μmol/L）83.26±15.02 85.15±15.69 169.65±32.65ab 415.481＊＊eGFR［mL/（min·1.73 m2）］105.26±9.57 104.72±9.08 75.15±9.56ab 311.116＊＊24 h尿蛋白定量（g）0.05±0.01 0.06±0.02 2.65±0.72ab 940.744＊＊

Tab.2 Comparison of serum NETs,DNASE1 levels,renal function,renal tissue AI and CI scores between LN patients with different disease activity表2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 （±s）

Tab.2 Comparison of serum NETs,DNASE1 levels,renal function,renal tissue AI and CI scores between LN patients with different disease activity表2 不同疾病活動度LN患者血清NETs、DNASE1水平、腎功能、腎組織AI和CI評分比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與輕度活動組比較；b與中度活動組比較，P＜0.05。

組別輕度活動組中度活動組重度活動組F n 31 33 28 NETs（μg/L）0.81±0.09 1.02±0.25a 1.25±0.05ab 67.193＊＊DNASE1（μg/L）3.48±0.10 3.06±0.32a 2.46±0.05ab 196.048＊＊BUN（mmol/L）33.15±2.49 36.81±5.16a 45.26±2.03ab 106.179＊＊Scr（μmol/L）142.13±7.56 177.96±10.38a 190.32±6.15ab 254.911＊＊eGFR［mL/（min·1.73 m2）］82.16±2.03 75.35±4.04a 67.15±1.25ab 176.230＊＊24 h尿蛋白定量（g）2.09±0.08 2.78±0.32a 3.12±0.15ab 245.236＊＊AI評分（分）10.26±2.03 15.02±2.95a 19.35±3.28ab 91.757＊＊CI評分（分）5.26±1.09 7.15±1.52a 9.38±1.96ab 67.835＊＊

Tab.3 Comparison of clinical data between different prognostic groups表3 不同預(yù)后組臨床資料比較

Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis of LN prognosis表4 影響LN預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.5 NETs預(yù)測LN預(yù)后的價值分析 NETs預(yù)測LN患者預(yù)后的截斷值為1.06μg/L，曲線下面積（AUC）為0.871（0.785～0.932），敏感度為80.00%，特異度為86.57%，約登指數(shù)為0.666。見圖1。

Fig.1 ROC curve for NETs predicting LN prognosis圖1 NETs預(yù)測LN預(yù)后的ROC曲線

3 討論

LN是由SLE過程中產(chǎn)生的自身免疫性抗原-抗體復(fù)合物沉積在腎臟造成的損害所致。免疫功能障礙是LN發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，免疫系統(tǒng)在維持免疫應(yīng)答和自身抗體免疫耐受平衡間發(fā)揮重要作用，免疫應(yīng)答受損或過度免疫應(yīng)答可導(dǎo)致T、B淋巴細(xì)胞活化失調(diào)，促使自身抗體產(chǎn)生，免疫復(fù)合物形成［13］。中性粒細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中含量最豐富的細(xì)胞組分，在分化成熟后通過分泌細(xì)胞因子、吞噬、脫顆粒等方式殺滅病原菌，是機(jī)體固有免疫的重要組成部分。近年來研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞存在新的防御途徑，中性粒細(xì)胞在受到細(xì)菌、病毒、其他病原體感染刺激后可釋放出一種以DNA為框架的附著豐富顆粒蛋白和肽類物質(zhì)的網(wǎng)狀纖維，可直接捕獲病原菌，這種結(jié)構(gòu)被稱為NETs，其形成和排出細(xì)胞外的過程被稱為NETosis［14］。

NETs主要由胞質(zhì)蛋白、解聚染色質(zhì)和顆粒組成，釋放至胞外的NETs與彈性蛋白酶、防御素和活性氧共同形成防御網(wǎng)絡(luò)，捕獲和殺死入侵病原菌，具有宿主防御作用［15］。但是，NETs過度釋放或清除不及時可能給宿主帶來潛在損害，與自身免疫性疾病發(fā)病及其器官受損有關(guān)［16］。有研究顯示風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液中NETs含量增高，NETs網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)附著大量風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎瓜氨酸化抗原來源的肽?；彼崦搧啺访?、4［17］。與健康人群相比，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清NETs含量明顯增高，NETs含量與抗瓜氨酸肽抗體呈正相關(guān)［18］。NETs與SLE亦存在密切關(guān)系，SLE患者降解NETs能力低于健康人群，NETs清除障礙可導(dǎo)致血清抗雙鏈DNA抗體增加和SLE癥狀加重［19］。NETs過度合成可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，激活基質(zhì)金屬蛋白酶2，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，參與SLE發(fā)病機(jī)制［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)LN患者血清NETs水平明顯高于SLE組和對照組，NETs水平隨著疾病活動度增加而升高，相關(guān)性分析結(jié)果示NETs水平與24 h尿蛋白定量、腎組織AI、CI評分呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，說明NETs水平增加與SLE活動度增加、腎組織損傷以及腎功能下降密切相關(guān)。Bruschi等［21-22］也指出部分SLE患者降解NETs的功能受損，導(dǎo)致循環(huán)血中NETs增加和累積，與LN發(fā)病有關(guān)。分析原因為：NETs由DNA組成，NETs產(chǎn)生過程中釋放的活性氧可修飾DNA和蛋白質(zhì)，使其具有免疫原性（指能引起免疫應(yīng)答的性能），NETs是產(chǎn)生抗DNA自身抗體的主要來源，而抗DNA抗體是SLE特異性抗體之一，當(dāng)NETs持續(xù)存在時可導(dǎo)致抗DNA抗體產(chǎn)生，免疫復(fù)合物形成并沉積于腎臟，促使腎小球腎炎發(fā)展［22］。Wang等［23］在SLE患者NETs中檢測到線粒體DNA（mtDNA），表明NETs是SLE患者抗DNA抗體的主要自身抗原來源，mtDNA/抗mtDNA抗體可通過Toll樣受體激活漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞和Ⅰ型干擾素，促使疾病活動增加和LN發(fā)生。DNASE1為降解NETs所必需，NETs在炎癥部位產(chǎn)生后隨即被DNASE1降解清除，DNASE1活性降低可導(dǎo)致NETs持續(xù)存在［24］，DNASE1缺陷可導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生，增加小鼠患SLE的風(fēng)險，發(fā)生更嚴(yán)重的腎損傷［25］。本研究相關(guān)性分析結(jié)果也顯示，血清NETs水平與DNASE1呈負(fù)相關(guān)，提示DNASE1缺失可能介導(dǎo)了NETs清除障礙，增加NETs腎損傷作用。

本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良組血清NETs水平高于預(yù)后良好組，高NETs水平是LN腎臟相關(guān)終點事件發(fā)生的主要危險因素，說明NETs可作為LN預(yù)后評估的參考指標(biāo)。ROC分析結(jié)果顯示NETs預(yù)測LN預(yù)后的AUC為0.871，敏感度和特異度達(dá)80.00%、86.57%，提示NETs具有一定的LN預(yù)后評估效能，可為臨床患者預(yù)后判斷提供參考。

綜上，SLE、LN患者血清NETs水平均升高；與SLE患者相比，LN患者血清NETs水平更高。NETs持續(xù)升高與SLE活動度增強(qiáng)、腎損傷和腎功能障礙有關(guān)，NETs可能參與SLE進(jìn)展為LN的過程。高水平NETs是LN患者發(fā)生腎臟終點事件的危險因素，NETs可作為LN預(yù)后評估的潛在指標(biāo)。