卵泡液中SCF和SDF-1水平與POI的發(fā)生及胚胎發(fā)育的相關(guān)性研究

劉寶玲，張靜，衷雪梅，金萱△

原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insuffi?ciency，POI）是由卵巢自身?yè)p傷引起的一種卵巢功能障礙，患者主要癥狀是40歲前月經(jīng)周期不規(guī)律，可通過檢測(cè)到卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）升高和雌二醇（estradiol，E2）降低而確診［1］。POI的發(fā)生機(jī)制包括卵泡儲(chǔ)備形成異常、卵泡閉鎖增加、優(yōu)勢(shì)卵泡募集受損、卵泡成熟受阻、卵泡儲(chǔ)備過度消耗等，最終導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，影響女性生殖功能［2］。多種細(xì)胞因子通過旁分泌和自分泌在卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育中起著重要作用，如抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長(zhǎng)分化因子-9等［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1能抑制原始卵泡的激活［5］；而SCF能通過上調(diào)其受體c-kit mRNA表達(dá)和絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化參與卵泡發(fā)育，促進(jìn)原始卵泡的激活［6］。本研究通過分析POI患者卵泡液中SDF-1和SCF的表達(dá)特點(diǎn)及其相關(guān)性，探討SDF-1和SCF在POI發(fā)生發(fā)展中的作用，同時(shí)初步研究卵泡液SCF水平對(duì)輔助生殖治療中胚胎發(fā)育情況的預(yù)測(cè)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年10月—2021年1月于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院輔助生殖中心行體外受精（IVF）治療的144例不孕患者。POI診斷標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜40歲，F(xiàn)SH＞20 IU/L［7］。144例中POI患者（POI組）44例。將無(wú)基礎(chǔ)卵巢疾病，因輸卵管或男方因素就診的不孕患者根據(jù)年齡分為高齡組（年齡≥40歲，40例）和正常組（年齡＜40歲，60例）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲狀腺、腎上腺等疾病。（2）多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮畸形、宮腔粘連。（3）既往有結(jié)核病史、糖尿病史等其他系統(tǒng)疾病。根據(jù)卵泡液SCF水平，將POI組分為＜200 ng/L組、200~300 ng/L組和＞300 ng/L組3個(gè)亞組。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè) 患者行促排卵治療后，于取卵日留取第1管卵泡直徑≥16 mm且無(wú)明顯血染的卵泡液，3 000 r/min離心10 min后，取上清液留置于Eppendorf管，標(biāo)記后-80℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，按照ELISA試劑盒（江蘇晶美生物公司）操作說明，分別檢測(cè)已收集卵泡液中E2、SDF-1和SCF的蛋白表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) 于月經(jīng)周期第2～3天檢測(cè)基礎(chǔ)FSH、AMH，基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)為月經(jīng)周期第2～4天測(cè)得的2～10 mm直徑的卵泡數(shù)量。正常受精率=正常受精卵子數(shù)/加精卵子總數(shù)×100%；卵裂率=D2卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%。優(yōu)質(zhì)胚胎定義為來(lái)源于正常受精卵，且受精后第3天胚胎細(xì)胞數(shù)為7~9個(gè)、細(xì)胞大小符合發(fā)育階段、碎片程度小于10%、無(wú)多核化的胚胎。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差不齊行非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基本情況的比較 3組間體質(zhì)量指數(shù)（BMI）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。POI組與正常組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；POI組基礎(chǔ)FSH高于正常組，基礎(chǔ)AMH、竇卵泡數(shù)低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高齡組基礎(chǔ)FSH高于正常組，基礎(chǔ)AMH、竇卵泡數(shù)低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of basic conditions between the three groups表1 不同組間基本情況比較 （±s）

Tab.1 Comparison of basic conditions between the three groups表1 不同組間基本情況比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，P＜0.05。

組別正常組POI組高齡組F n 60 44 40年齡（歲）31.4±4.8 32.8±4.9 42.4±1.9a 87.174＊＊BMI（kg/m2）22.0±3.2 22.3±3.2 22.7±2.1 0.737基礎(chǔ)FSH（IU/L）7.0±2.4 23.2±2.6a 10.5±2.0a 589.400＊＊基礎(chǔ)AMH（μg/L）3.5±0.5 0.7±0.4a 1.1±0.5a 449.121＊＊竇卵泡數(shù)（個(gè)）9.8±4.6 4.6±2.2a 6.2±3.1a 27.780＊＊

2.2 不同組間卵泡液指標(biāo)比較 POI組、高齡組的卵泡液SCF水平均高于正常組，POI組卵泡液E2、SDF-1均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高齡組與正常組間卵泡液E2、SDF-1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the levels of E2,SDF-1 and SCF in follicular fluid between the three groups表2 不同組間卵泡液E2、SDF-1、SCF水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of the levels of E2,SDF-1 and SCF in follicular fluid between the three groups表2 不同組間卵泡液E2、SDF-1、SCF水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，P＜0.05。

組別正常組POI組高齡組F n 60 44 40 E2（pmol/L）49.1±20.4 35.0±6.7a 43.5±13.4 9.019＊＊SDF-1（ng/L）9 760.4±2 309.2 7 539.3±1 836.4a 10 066.8±2 921.8 15.044＊＊SCF（ng/L）74.1±58.3 264.9±83.0a 144.6±89.3a 74.590＊＊

2.3 卵泡液中SCF與SDF-1的相關(guān)性 POI組卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.400，P＜0.05），正常組+高齡組患者（無(wú)卵巢疾?。┞雅菀褐蠸CF與SDF-1水平未見明顯相關(guān)性（rs=0.201，P＞0.05），見圖1。

2.4 卵泡液中SCF與E2的相關(guān)性分析 POI組卵泡液中SCF與E2水平呈正相關(guān)（rs=0.341，P＜0.05），正常組+高齡組患者（無(wú)卵巢疾病）卵泡液中SCF與E2水平未見明顯相關(guān)性（rs=0.031，P＞0.05），見圖2。

Fig.1 Correlation analysis of SCF and SDF-1 levels圖1 SCF與SDF-1水平相關(guān)性分析

Fig.2 Correlation analysis of SCF and E2 levels in follicular fluid圖2 SCF與E2水平相關(guān)性分析

2.5 卵泡液中SCF水平與胚胎發(fā)育的關(guān)系 POI組的3個(gè)SCF水平亞組間正常受精率、卵裂率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；＜200 ng/L組、200～300 ng/L組的優(yōu)胚率均低于＞300 ng/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

卵巢是女性產(chǎn)生和排出卵子的性腺，具有生殖和內(nèi)分泌雙重功能。卵泡主要由卵母細(xì)胞及其周圍的顆粒細(xì)胞組成，卵泡發(fā)育經(jīng)歷了原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡和排卵前卵泡，并最終排卵［3］。內(nèi)源性或外源性因素引起卵泡任一階段的發(fā)育異常，均有可能導(dǎo)致POI。POI除導(dǎo)致不孕外，還會(huì)增加骨折、情緒障礙、心血管疾病、2型糖尿病等多系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)［8-9］。因此研究POI的發(fā)病機(jī)制和治療方法十分必要。

Tab.3 Comparison of embryo development in POI subgroups表3 POI亞組內(nèi)胚胎發(fā)育情況的比較

SCF是一種二聚體分子，通過結(jié)合并激活酪氨酸激酶受體c-kit發(fā)揮生物學(xué)功能。SCF/c-kit系統(tǒng)在造血、配子發(fā)育、黑色素生成、切口愈合等過程中發(fā)揮重要作用［10］。在成熟的卵巢中，c-kit在卵母細(xì)胞中表達(dá)，而SCF主要由顆粒細(xì)胞分泌，SCF、c-kit相互作用，在卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間建立通信，參與原始卵泡的發(fā)育、初級(jí)卵泡的生長(zhǎng)和排卵前卵泡的出現(xiàn)［11］。SCF/c-kit被認(rèn)為在卵泡形成中起關(guān)鍵調(diào)控作用，SCF促進(jìn)了原始卵泡到次級(jí)卵泡的生長(zhǎng)，與原始卵泡的激活相關(guān)［6］。有研究在卵巢早衰大鼠的卵巢組織中觀察到SCF mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照大鼠［12］。本研究結(jié)果顯示POI組患者卵泡液SCF水平明顯高于正常組，提示高表達(dá)的SCF可能通過過度刺激原始卵泡的激活導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備減少，引發(fā)POI。高齡患者基礎(chǔ)FSH水平高于正常組，基礎(chǔ)AMH、竇卵泡數(shù)低于正常組，表明高齡患者卵巢儲(chǔ)備低于正常組患者；而高齡組卵泡液SCF水平高于正常組，提示SCF與高齡患者卵巢儲(chǔ)備減退發(fā)生機(jī)制有關(guān)。卵泡液中參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的細(xì)胞因子不是相互獨(dú)立的，它們之間也會(huì)有聯(lián)系，如AMH對(duì)SCF的負(fù)調(diào)控作用［13-14］，過表達(dá)的FGF-2對(duì)SCF旁分泌的促進(jìn)作用［15］，SCF和內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β之間的關(guān)聯(lián)［16］等。SCF與其他細(xì)胞因子之間的作用機(jī)制值得深入研究。

SDF-1也稱為CXC趨化因子配體12（CXCL12），通過與其特異性受體CXCR4結(jié)合參與腫瘤轉(zhuǎn)移、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、心臟重構(gòu)、血管生成等過程［17］。本研究結(jié)果顯示，POI組患者卵泡液SDF-1低于正常組，同時(shí)POI組卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負(fù)相關(guān)，而正常、高齡組患者卵泡液中SCF與SDF-1水平未見明顯相關(guān)性，提示在POI的發(fā)生發(fā)展中SCF與SDF-1之間可能存在相互作用機(jī)制。有研究表明SDF1/CXCR4信號(hào)通路可能在維持原始卵泡池的大小和壽命方面發(fā)揮重要作用，使卵泡處于非激活狀態(tài)［5］，而SCF促進(jìn)了原始卵泡的激活。SCF與SDF-1之間的相互作用可能與它們?cè)诰S持原始卵泡池中相反的作用有關(guān)，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

對(duì)于有生育要求的POI患者，通過輔助生殖技術(shù)獲得妊娠已經(jīng)成為重要的治療手段。輔助生殖治療中胚胎發(fā)育結(jié)局的預(yù)測(cè)指標(biāo)的相關(guān)研究更有意義。為研究SCF對(duì)POI患者胚胎發(fā)育情況的預(yù)測(cè)作用，本研究將POI組患者按SCF水平分為3個(gè)亞組并進(jìn)行胚胎發(fā)育情況比較，結(jié)果顯示＜200 ng/L組、200～300 ng/L組的優(yōu)胚率均低于＞300 ng/L組，這提示對(duì)POI患者來(lái)說，相對(duì)高水平的卵泡液SCF可能預(yù)示相對(duì)較高水平的胚胎質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)POI患者卵泡液中SCF與E2水平呈正相關(guān)，E2是促進(jìn)卵母細(xì)胞、卵泡發(fā)育的重要影響因素。POI指的是從不規(guī)則排卵到過早絕經(jīng)的一個(gè)連續(xù)的卵巢功能衰退過程，部分確診患者有時(shí)還會(huì)自發(fā)地出現(xiàn)卵泡發(fā)育、月經(jīng)回潮、妊娠［18］。在POI發(fā)展早期，機(jī)體可能存在補(bǔ)償機(jī)制以維持卵巢生殖和內(nèi)分泌功能。筆者認(rèn)為，SCF可能參與了這一補(bǔ)償機(jī)制，使得部分POI患者SCF水平進(jìn)一步升高，促進(jìn)了胚胎發(fā)育。有研究表明，SCF顯著增加了水牛卵母細(xì)胞直徑，促進(jìn)了水牛卵母細(xì)胞的成熟［19］。SCF對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，可能是預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育的重要原因。有一項(xiàng)基于人類3PN胚胎和小鼠2PN胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，添加SCF促進(jìn)了優(yōu)質(zhì)胚胎、囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚的形成，同時(shí)添加SCF和c-kit抑制劑會(huì)削弱這種促進(jìn)作用［20］，提示SCF對(duì)胚胎發(fā)育具有一定預(yù)測(cè)作用。但也有研究表明在卵巢低反應(yīng)的患者中，血清或卵泡液中的SCF水平并不能預(yù)測(cè)接受體外受精患者的卵母細(xì)胞提取率［21］。這可能與POI和卵巢低反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制不同有關(guān)。關(guān)于卵泡液SCF對(duì)接受輔助生殖治療患者胚胎發(fā)育情況的預(yù)測(cè)作用還需要更大樣本量的研究進(jìn)一步探討。

綜上所述，POI患者和高齡患者卵泡液中SCF呈高水平表達(dá)，SCF可能與POI的發(fā)生、發(fā)展和高齡導(dǎo)致的卵巢儲(chǔ)備降低有關(guān)。POI患者卵泡液中SCF與SDF-1水平呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)兩者可能在原始卵泡池維持上有相互作用機(jī)制，共同誘發(fā)POI。卵泡液SCF水平可能是預(yù)測(cè)POI患者IVF治療后胚胎發(fā)育的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究為原發(fā)性卵巢功能不全發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究提供了新證據(jù)，為其臨床治療提供了新思路。