益生菌在虹鱒養(yǎng)殖中的研究與應(yīng)用

樊丹，李紹戊，盧彤巖，王荻

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海 201306）

益生菌一詞由拉丁語“pro”（代表）和“bios”（生命）構(gòu)成。糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）則將益生菌定義為一種對宿主具有一定積極作用的活微生物。Basoulis 等認(rèn)為，益生菌是活的微生物（細(xì)菌、酵母），足量使用可對宿主產(chǎn)生積極作用[1-3]。目前，益生菌被定義為對宿主健康有有益影響的微生物或化合物，其中微生物包括酵母菌、細(xì)菌和藻類[4]。自20 世紀(jì)80 年代以來，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越加廣泛。

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特而廣受消費者喜愛,是一種適應(yīng)性較廣的冷水性魚類。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，機體免疫力下降等問題嚴(yán)重制約著我國虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。盡管漁用藥物仍然是控制病害的主要手段，但片面追求時效與經(jīng)濟利益以及養(yǎng)殖從業(yè)人員科學(xué)用藥意識淡薄，抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，帶來藥物殘留、微生物耐藥性等食品衛(wèi)生和環(huán)境安全問題。使用益生菌能提高虹鱒的生長性能，增強免疫功能，減少用藥劑量[5-9]。

益生菌在醫(yī)療、生物發(fā)酵、基因工程等方面的研究和應(yīng)用廣泛，但在虹鱒養(yǎng)殖中尚缺乏系統(tǒng)性研究的綜述。本文簡要介紹了益生菌的分類、補充方式，綜述了益生菌在虹鱒養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展，歸納了其對虹鱒的益生效果及益生機理，可為發(fā)展綠色高效的虹鱒養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 益生菌分類

根據(jù)2013 年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第105號公告》，允許飼料使用的微生物添加劑如表1 所示。在虹鱒養(yǎng)殖及相關(guān)研究與應(yīng)用中，常用的益生菌包括：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌以及其他菌類。其中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是厭氧或兼性厭氧的細(xì)菌，在自然界分布廣泛。從細(xì)菌分類學(xué)上可分為：乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和奇異菌屬（Atopobium）等[10]。乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，適宜生長溫度為37℃左右，最適pH5.5～6.5，在腸道發(fā)酵產(chǎn)生有機酸和酶等物質(zhì)，對宿主的生理功能、免疫系統(tǒng)、營養(yǎng)狀態(tài)、毒性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等具有重要調(diào)節(jié)作用[11]，是健康動物腸道中的優(yōu)勢菌群，可維持腸道微生態(tài)平衡和機體健康[12]。芽孢桿菌中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）較為常用，它是一種好氧型革蘭氏陽性菌，耐高溫、耐酸堿、耐防腐劑，在飼料制作中易存活、易加工、便于儲藏[13]。酵母菌是一類以芽殖為主的兼性厭氧型真菌，適宜生長溫度為25℃，富含蛋白質(zhì)、B 族維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)和輔酶A、輔酶I 及輔酶Q 等酶類，能夠促進(jìn)腸道其他益生菌的生長，提高水產(chǎn)動物的消化率，增強機體免疫力[14,15]。其他一些菌類也可增強魚體免疫機能，如沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）可顯著提高虹鱒的生長性能[16]。

表1 農(nóng)業(yè)部第105 號公告公布飼料允許的微生物添加劑Tab.1 Microbial feed additives approved in Announcement No.105 of the Ministry of Agriculture

2 益生菌的補充方式

益生菌的補充需要探索最適補給方式、最適劑量，并保證益生菌在干燥的顆粒中存活[17]。種類、劑型、補給載體、劑量水平和投喂時間等因素均影響益生效果。益生菌的補充方式包括：口服、注射和益生菌組合使用，常見的方式為投喂或灌喂。在魚類養(yǎng)殖中，飼料通常作為有效載體，將益生菌或益生菌細(xì)胞成分添加到飼料中，投喂或潑灑至養(yǎng)殖水環(huán)境中提供食物或保護劑以防感染[18,19]。Salinas 等[20]將乳酸菌和枯草芽孢桿菌等熱滅活后投喂金頭鯛（Sparus aurata L.），能有效刺激魚體免疫系統(tǒng)；Scott等通過腹腔或者肌肉注射方式補充益生菌后，顯著提高了虹鱒抵抗嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）感染的能力[21]。除單一菌種外，多種益生菌的混合使用對許多物種和養(yǎng)殖水環(huán)境均具有積極作用[22,23]。

3 益生菌對虹鱒的益生效果

3.1 生長性能

益生菌具有顯著提高虹鱒生長性能的作用。在飼料中添加釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）飼喂虹鱒成魚90 d 后，其餌料系數(shù)（FCR）明顯降低，體質(zhì)量顯著增加[24,25]。Merrifield 等給虹鱒飼喂添加了枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和糞腸球菌（E.faecalis）的混合飼料，其FCR 顯著下降，特定生長率提高，表明復(fù)合益生菌可有效促進(jìn)虹鱒生長[26]。保加利亞桿菌（L.elbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）和檸檬酸桿菌（Citrobacter farmeri）均可顯著提高虹鱒幼魚的增重率、特定生長率和相對增重率，降低FCR[27]。

3.2 消化酶活性

提高虹鱒腸道消化酶活性有助于機體分解營養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料利用率，促進(jìn)機體生長發(fā)育[9]。長期飼喂含有保加利亞桿菌的飼料能顯著提高虹鱒后腸淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性[27]。Reza 等[28]的研究結(jié)果與上述相似：當(dāng)糞腸球菌的補充水平達(dá)到1.0×109cfu/g 時，虹鱒腸道的脂肪酶、胰蛋白酶活性顯著提高。然而，部分益生菌未影響腸道消化酶的活性，如Harbi 等[29]發(fā)現(xiàn)Kocuria SM1 和Rhodococcus SM2 對虹鱒的消化酶指標(biāo)無影響。

3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)

補充外源益生菌后，虹鱒腸道菌落總數(shù)增加，細(xì)菌物種豐富度增加，致病菌的粘附性降低，機體免疫力提高[7]。Mohammadian 等[27]研究結(jié)果表明，長期飼喂含有嗜酸乳桿菌的飼料后，虹鱒幼魚腸道的乳酸菌數(shù)量和菌落總數(shù)顯著增加。Sharifuzzaman 等[28]發(fā)現(xiàn)：糞腸球菌的補充水平為1.0×108cfu/g 時，虹鱒腸道益生菌數(shù)量和菌落總數(shù)顯著增加。Ramos等[30]發(fā)現(xiàn)商業(yè)益生菌添加劑（主要為芽孢桿菌、乳酸菌），能促使虹鱒腸道菌落總數(shù)顯著增加，微生物豐富度顯著增加。

3.4 免疫參數(shù)

3.4.1 血細(xì)胞參數(shù)

紅細(xì)胞增多可增強機體的攜氧能力，而白細(xì)胞增多通常表示機體免疫應(yīng)答能力增強[16]。長期投喂含酵母的混合飼料后，虹鱒血液中的紅細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，白細(xì)胞中的單核細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在飼料中添加腸桿菌和乳酸菌等同樣可以提高虹鱒白細(xì)胞數(shù)量[27,31,32]。

3.4.2 血清參數(shù)

血清參數(shù)在一定程度上可以反映機體的健康狀況。血清中的膽固醇水平可以反映機體內(nèi)分泌平衡狀態(tài)；溶菌酶活性、補體活性、血清蛋白活性、呼吸爆發(fā)活性等與免疫反應(yīng)與生長性能密切相關(guān)[17]。Mohammadian[27]和Hoseinifar[33]等研究結(jié)果表明，添加酵母菌使虹鱒血清膽固醇水平顯著降低，血清溶菌酶活性顯著升高，呼吸爆發(fā)活性降低，補體活性ACH50顯著升高。在飼料中補充添加腸桿菌、乳酸菌、芽孢桿菌等常用益生菌后，虹鱒的血清蛋白、IgM 抗體、組織相容性復(fù)合物、免疫球蛋白等蛋白活性增高[7,9,34]。

3.4.3 基因表達(dá)

常見的如腫瘤壞死因子、白介素、胰島素因子等mRNA 表達(dá)水平的變化與機體免疫功能或生長性能有關(guān)[17]。以乳酸菌為食源益生菌，抑制了虹鱒脾臟中腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素（IL-1β）的mRNA 表達(dá)水平；以酵母菌為食源益生菌，脾臟中TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)[24]。長期補給植物乳桿菌、乳酸乳球菌（L.lactis）和腸系膜球菌（Leuconostic mesenteroides）等益生菌，可促進(jìn)虹鱒頭腎中炎癥細(xì)胞因子基因（TNF-α 和IL-1β）上調(diào)表達(dá)，腸道中胰島素生長因子IGF-2、脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（FATP）、γ-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（γ-GTP）、IL-1β、IL-8和IL-10 基因的mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)[35-37]。

4 益生菌的益生機制

4.1 鐵的競爭

生物需要補充營養(yǎng)以維持生存、生長和繁殖等生命活動。在多種營養(yǎng)元素中，鐵元素在DNA 復(fù)制、氧氣運輸、抗氧化應(yīng)激、酶活性和能量生成等具有重要作用，也是構(gòu)成鐵載體的必需元素[38]。鐵載體是細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的低分子量鐵螯合化合物。益生菌產(chǎn)生的鐵載體對鐵離子具有更高的親和力，能降低病原對鐵的利用性能和對能量的利用能力，增強魚體的免疫力與抗病性[39-41]。

4.2 抑菌性能

細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素或其他代謝物可抑制甚至殺死其他細(xì)菌，以獲得更廣的生存空間與更多的營養(yǎng)物質(zhì)[42]。如枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素等物質(zhì)抑制其他細(xì)菌的增殖[43]。黏膜免疫相關(guān)研究結(jié)果表明，致病菌進(jìn)入水生動物腸道并附著定殖在腸道黏膜表面最終導(dǎo)致疾病[44]，但是益生菌可以抑制病原菌的增殖，阻斷其附著位點，降低致病菌與腸道黏膜的結(jié)合性能，減少病原菌對宿主的損害[44,45]。保加利亞桿菌能夠定殖在魚腸黏液中，誘導(dǎo)腸道pH 降低，達(dá)到抑制病原微生物增殖的效果[46,47]。

4.3 提高酶活性

益生菌能產(chǎn)生不同種類的細(xì)胞外酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等調(diào)節(jié)宿主的新陳代謝過程，而魚體自身能夠產(chǎn)生多種內(nèi)源酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、植酸酶、堿性磷酸酶等重要的消化酶[48]。內(nèi)源性和外源性淀粉酶在草食性和雜食性魚類中非常重要，能將復(fù)雜的多糖物質(zhì)降解為簡單的單糖，促進(jìn)腸道對糖類物質(zhì)的吸收[49]。當(dāng)內(nèi)源酶的數(shù)量和活性不足時，補充益生菌產(chǎn)生的外源性消化酶對提高消化酶活性、營養(yǎng)物質(zhì)利用率、生長性能和促進(jìn)消化吸收等具有重要作用[50]。

4.4 免疫調(diào)節(jié)

魚類的免疫系統(tǒng)是機體保護其免受病原感染的有效手段。近年來黏膜免疫的研究備受關(guān)注，其中有關(guān)腸粘膜的相關(guān)報道表明，腸黏膜的上皮細(xì)胞、黏液、微生物或黏膜下層的免疫細(xì)胞能夠相互作用，維持腸道正常生理功能，提高腸道的消化吸收能力，增強免疫反應(yīng)[51]。攝食益生菌可調(diào)節(jié)腸道微生物組成（通常增加有益微生物的數(shù)量），抑制致病菌的增殖。益生菌可誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和補體系統(tǒng)，使白細(xì)胞增多，細(xì)胞因子和趨化因子如TNF-α、白介素（IL-6、IL-10、IL-12）和IFN-C 表達(dá)上調(diào)，提高宿主抗病能力[52]。Brown等[53]和DeCoffe 等[54]的研究結(jié)果也支持該觀點。他們還發(fā)現(xiàn)魚類免疫系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)是溶菌酶，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的吞噬作用、呼吸爆發(fā)、以及超氧化物歧化酶和粘液的產(chǎn)生。

4.5 改善水質(zhì)

益生菌不僅可以提高魚類的免疫功能，還可以改善水質(zhì)。Padmavathi 等[55]認(rèn)為，益生菌可用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的生物防治劑或生物修復(fù)劑，添加至重金屬污染或藻類爆發(fā)的水環(huán)境中，可導(dǎo)致Pb、Cd、Hg、Ni 等重金屬污染物減少，藻類生長減緩，起到了抑制病原體，增加營養(yǎng)素濃度、溶解氧濃度和水生有益細(xì)菌種群的效果[56,57]。

4.6 提供營養(yǎng)成分

作為食物添加劑，益生菌在腸道內(nèi)降解時可提供β-葡聚糖等營養(yǎng)成分，與腸壁細(xì)胞核膜受體結(jié)合，產(chǎn)生信號傳送至腸道細(xì)胞膜受體，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄蛋白的激活、免疫基因的表達(dá)、細(xì)胞因子的合成和分泌[5]。Gantner 等[58]發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和乳酸乳球菌使得小鼠（Mus musculus）的IL-1β 和TNF-α 基因表達(dá)上調(diào)。他們認(rèn)為這或許與吞噬細(xì)胞中β-葡聚糖相關(guān)受體的存在有關(guān)。

4.7 益生菌與腦腸軸

哺乳動物的腸道和大腦存在腸-腦-腸的環(huán)路，具有調(diào)節(jié)小腸組織的局部生理活動、調(diào)控腸源性交感神經(jīng)元活動，檢測腸道微生物（如益生菌）及營養(yǎng)物質(zhì)含量變化的作用[59-63]。改變腸道菌群組成能激活腸投射神經(jīng)元，產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)控宿主的行為[64]。Rosengren 等[65]利用重復(fù)壓力限制測試，高壓條件下的虹鱒腸道完整性降低，虹鱒端腦中鹽皮質(zhì)激素受體和血清素（一種神經(jīng)遞質(zhì)）受體表達(dá)水平高；應(yīng)激激素皮質(zhì)醇是通過下丘腦-垂體-腎軸釋放的、血清素參與魚類的認(rèn)知過程與行為反應(yīng)。他們認(rèn)為下丘腦-垂體-腎軸參與了腦-腸軸調(diào)控過程。根據(jù)Rosengren 等[65]研究可知虹鱒可能也存在相應(yīng)的腦-腸軸調(diào)控機制，而對于虹鱒腸道益生菌與腦-腸軸的相互作用，今后應(yīng)做進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

使用益生菌能夠提高虹鱒生產(chǎn)性能、改善養(yǎng)殖水環(huán)境、增強機體免疫力，達(dá)到減少用藥的目的。但是，虹鱒養(yǎng)殖中使用益生菌的研究報道較少，存在以下問題：1）性能穩(wěn)定的益生菌種類不豐富，菌體抗逆性和安全性研究結(jié)果缺乏；2）益生菌的作用機理研究不夠深入；3）高質(zhì)量的益生菌產(chǎn)品（如飼料）需求大于市場供給；4）復(fù)合益生菌搭配不科學(xué)，特異性不強。為此，在虹鱒養(yǎng)殖中益生菌的研究可聚焦以下方面：1）重視益生菌的變異、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移及耐藥性等安全問題；運用高通量測序等技術(shù)手段分析菌群多樣性，以充實益生菌資源庫，提供優(yōu)良益生菌候選菌株；2）探索益生菌的最適投餌策略，包括投餌量、投餌方式、投餌載體等，達(dá)到科學(xué)飼養(yǎng)、環(huán)保經(jīng)濟的目的；3）加大研究力度，深入揭示益生菌作用機理、益生菌與宿主的相互作用；4）規(guī)范益生菌的復(fù)合使用，使其符合科學(xué)、合理、綠色經(jīng)濟的理念；5）重視益生菌及代謝產(chǎn)物的研究，利用基因工程、發(fā)酵工程等技術(shù)提高益生菌代謝產(chǎn)物得率。