基于DNaseⅠ輔助目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大的赭曲霉毒素A檢測(cè)方法

李宣儀，劉沙沙，劉 梅

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是自然界最為豐富的真菌毒素之一[1-3]，其毒性大、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熱穩(wěn)定性高且對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染最為嚴(yán)重，因與人類健康密切相關(guān)而受到廣泛關(guān)注。為了減少食品中真菌毒素對(duì)人體健康的危害，許多國(guó)家和國(guó)際機(jī)構(gòu)已對(duì)食品中部分真菌毒素設(shè)定了最高限量。在我國(guó)，根據(jù)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定，葡萄酒中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)為2.0 μg/kg，咖啡豆和咖啡粉中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)為5.0 μg/kg，速溶咖啡中赭曲霉毒素A的限量標(biāo)準(zhǔn)為10.0 μg/kg。

OTA的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有常規(guī)色譜法(如薄層色譜法和紫外可見(jiàn)光法)、熒光或質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)等[4-6]。然而，這些方法存在各自的缺陷，例如耗時(shí)長(zhǎng)、所需儀器昂貴、對(duì)工作人員技術(shù)水平要求較高或樣品制備復(fù)雜等，影響了其大范圍應(yīng)用。近年發(fā)展起來(lái)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[7-8]雖然從一定程度上克服了上述困難，但其檢測(cè)過(guò)程涉及繁瑣的洗滌步驟，且需要對(duì)抗體的儲(chǔ)存和應(yīng)用條件進(jìn)行嚴(yán)格控制，限制了其在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。

適配體作為目前應(yīng)用前景較為廣闊的一種分子受體，是1條長(zhǎng)度小于25 kDa的短單鏈核苷酸，可以在隨機(jī)單鏈文庫(kù)中利用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)方法體外篩選得到[9]。與抗體不同，適配體可以與目標(biāo)物進(jìn)行高親和力和高特異性的結(jié)合，轉(zhuǎn)化為精確的三維構(gòu)象[10]。雖然適配體的結(jié)合能力與抗體相似，但其合成更為簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性更高[11-13]。由于適配體的選擇性強(qiáng)、成本低廉且在多種條件下都具有高熱穩(wěn)定性[14-15]，已逐漸廣泛應(yīng)用于多種靶分子(肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)分子、無(wú)機(jī)分子等)的檢測(cè)[16-18]。同時(shí)，適配體也被認(rèn)為是生物傳感器的理想識(shí)別元件[19]，并越來(lái)越多地應(yīng)用于醫(yī)療[20]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[21]和食品分析等領(lǐng)域。

氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的氧化物，具有單個(gè)原子層，其表面的六元環(huán)可以通過(guò)與DNA基本環(huán)狀結(jié)構(gòu)的π—π堆積作用實(shí)現(xiàn)表面DNA吸附，進(jìn)而猝滅標(biāo)記有6-羧基熒光素(FAM)的DNA。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氧化石墨烯可以有效地猝滅FAM熒光，且FAM可以在遠(yuǎn)離氧化石墨烯的情況下恢復(fù)熒光[22]，而酶可以在上述目標(biāo)物的循環(huán)利用過(guò)程中起到信號(hào)放大作用。因具有良好的親水性、生物相容性、安全性和無(wú)毒性，氧化石墨烯非常適用于食品中真菌毒素的檢測(cè)。聚乙烯基吡咯烷酮(poly-vinylpyrrolidone，PVP)是一種非離子型高分子化合物，可溶于水，毒性低且生理相容性好，在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有良好的發(fā)展前景。

基于此，本研究選用氧化石墨烯作為檢測(cè)赭曲霉毒素A的猝滅劑，使用PVP作為氧化石墨烯的包被材料[22-23]，試圖通過(guò)借助PVP修飾的氧化石墨烯減弱赭曲霉毒素A和氧化石墨烯之間的非特異性吸附，降低背景；同時(shí)利用脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)催化靶標(biāo)再循環(huán)，放大相關(guān)熒光信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)赭曲霉毒素A快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

FAM(6-羧基熒光素)修飾的適配體寡核苷酸序列(5′-FAM-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3′)由上海生物工程股份有限公司合成。

氧化石墨烯(GO)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)、赭曲霉毒素C(ochratoxin C，OTC)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和華法林(warfarin)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。通過(guò)將OTA溶解在無(wú)水乙醇中，并在20 ℃條件下儲(chǔ)存，獲得OTA儲(chǔ)備溶液(1 mmol/L)。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP，分子重為8 000、24 000、58 000)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)和無(wú)水氯化鈣(CaCl2)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。Tris(C4H11NO3)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。所有化學(xué)品均為分析純，使用前未進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)中使用的水均為超純水(Millipore-Q 18.2 MΩ·cm)，由純水裝置處理所得。

1.2 儀器和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用儀器和設(shè)備如下：F-4600熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)、圓二色光譜儀(UK Applied Photonics)、U-3000高效液相色譜儀(American Thermal Power 公司)、Thermo Scientific Orion Star A111臺(tái)式pH測(cè)量?jī)x(Thermo Fisher Scientific 公司)、QB-600高速振蕩混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、金屬浴(卡尤迪生物科技有限公司)、超純水裝置(Millipore Simplicity 185)、Allegra X-30R型多功能臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)、恒溫混合器(杭州典盛儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)中記錄反應(yīng)體系在492 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，發(fā)射波長(zhǎng)為500～630 nm的發(fā)射光譜。

1.3 方法

1.3.1 適配體構(gòu)象改變的圓二色光譜圖分析

（c）I borrowed the book from the library， I can keep for a week.

使用前將圓二色光譜儀用干燥的純化氮?dú)饷撗?，并在?shí)驗(yàn)期間維持在氮?dú)猸h(huán)境中。將DNA適配體溶液(1 μmol/L)放入圓二色光譜儀的光學(xué)室(路徑長(zhǎng)度為1 cm，體積為1 mL)進(jìn)行掃描，掃描速度為200 nm/min；采用1 nm的帶寬和1 s的時(shí)間常數(shù)，以0.1 nm的間隔收集240～340 nm的數(shù)據(jù)，每個(gè)溶液掃描3次。圓二色光譜圖扣除緩沖溶液的背景信號(hào)。

1.3.2 赭曲霉毒素A的測(cè)定

按照訂購(gòu)說(shuō)明，在上海生物工程股份有限公司合成的適配體DNA(aptamer)序列中加入相應(yīng)體積的10 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液(120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2，pH=8.0)，水浴加熱到 90 ℃，維持10 min ，逐漸冷卻至室溫，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中冷藏備用。

在赭曲霉毒素A的測(cè)定中，先使用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液將FAM標(biāo)記的適配體DNA儲(chǔ)備溶液稀釋至200 nmol/L，再將50 μL上述適配體DNA溶液與25 μL不同濃度的赭曲霉毒素A溶液在37 ℃水浴中混合30 min；加入20 μL的40 μg/mL氧化石墨烯/聚乙烯吡咯烷酮(GO/PVP)溶液并在室溫下孵育30 min，加入40 U DNase Ⅰ后繼續(xù)孵育40 min，加入10 mmol/L Tris-HCl緩沖液至反應(yīng)體系總體積為200 μL。反應(yīng)體系震蕩均勻后通過(guò)F-4600熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度。OTA檢測(cè)限的計(jì)算方法為3σ/S，其中，σ為11次空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為得到的線性關(guān)系斜率。

1.3.3 方法選擇特異性驗(yàn)證

選擇OTA的結(jié)構(gòu)類似物OTB、OTC、華法林及其他真菌毒素ZEN作為干擾物質(zhì)代表(1 μmol/L，體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶液溶解)，以對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)520 nm處的熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，基于DNaseⅠ輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大方式檢測(cè)對(duì)靶標(biāo)毒素OTA的選擇特異性。

1.3.4 樣品加標(biāo)檢測(cè)

按照國(guó)標(biāo)GB 5009.96—2016中高效液相-熒光方法檢測(cè)紅酒和咖啡粉中赫曲霉毒素A的操作對(duì)樣品進(jìn)行處理。

紅酒空白處理如下：實(shí)驗(yàn)前將待測(cè)紅酒置于4 ℃冰箱冷藏30 min，過(guò)濾或超聲脫氣后使用。稱取10 g 預(yù)處理紅酒，加入6 mL提取液(氫氧化鉀溶液(0.1 mol/L)∶甲醇∶水=2∶60∶38,體積比)混勻，氫氧化鉀溶液(0.1 mol/L)調(diào)pH至10.0，進(jìn)行固相萃取凈化。紅酒加標(biāo)處理如下：在10 g預(yù)處理后的紅酒中加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他操作同紅酒空白。使用本方法進(jìn)行檢測(cè)，并與標(biāo)準(zhǔn)高效液相-熒光檢測(cè)方法(GB 5009.96—2016)進(jìn)行比較。

咖啡粉空白處理如下：稱取2.5 g咖啡粉，加入25 mL提取液(甲醇∶碳酸氫鈉溶液(30 g/L)=1∶1，體積比)，于漩渦振蕩器上振蕩提取3～5 min，4 000 r/min離心10 min，濾紙過(guò)濾，取濾液10 mL進(jìn)行固相萃取凈化?？Х确奂訕?biāo)處理如下：在樣品中加入赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他操作同樣品空白。使用本方法進(jìn)行檢測(cè)，并與標(biāo)準(zhǔn)高效液相-熒光檢測(cè)方法(GB 5009.96—2016)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于DNase Ⅰ輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大方式檢測(cè)赭曲霉毒素A的原理

圖1為基于DNase Ⅰ輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大方式檢測(cè)赭曲霉毒素A的原理示意圖，其基本過(guò)程如下：當(dāng)OTA不存在時(shí)，F(xiàn)AM標(biāo)記的OTA適配體通過(guò)氧化石墨烯和核苷酸堿基之間的π—π堆疊，吸附到氧化石墨烯表面；由于從能量供體FAM到受體氧化石墨烯的距離縮短，產(chǎn)生了從FAM到氧化石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，F(xiàn)AM熒光可以有效地被氧化石墨烯猝滅。當(dāng)OTA存在時(shí)，經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到的OTA適配體可以與OTA發(fā)生特異性結(jié)合[24]，并從氧化石墨烯表面脫離，同時(shí)適配體構(gòu)象從單鏈的柔性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫械腉-四鏈體結(jié)構(gòu)[25]，氧化石墨烯對(duì)OTA適配體上標(biāo)記的FAM的猝滅作用減弱，F(xiàn)AM的熒光恢復(fù)。

圖1 基于DNase Ⅰ輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大方式檢測(cè)赭曲霉毒素A的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of OTA detection based on DNase Ⅰ-assisted target recycling signal amplification method

基于此，本方法通過(guò)監(jiān)測(cè)FAM的熒光恢復(fù)程度量化OTA濃度。有文獻(xiàn)報(bào)道，OTA在氧化石墨烯表面具有一定的吸附作用[22]，會(huì)限制目標(biāo)物循環(huán)，降低檢測(cè)靈敏度。針對(duì)該問(wèn)題，本研究中引入了氧化石墨烯的包被材料聚乙烯基吡咯烷酮，以減弱目標(biāo)物OTA和氧化石墨烯之間的非特異性吸附。同時(shí)，傳統(tǒng)方法中每個(gè)靶標(biāo)僅與1個(gè)適配體結(jié)合，極大地限制了測(cè)定OTA的靈敏度。因此，本研究中引入脫氧核糖核酸酶Ⅰ，使反應(yīng)體系發(fā)生靶標(biāo)循環(huán)，最終達(dá)到信號(hào)放大的目的。脫氧核糖核酸酶Ⅰ可以水解游離的FAM適配體，得到游離的FAM熒光素和目標(biāo)物OTA，而釋放的OTA可以與另一個(gè)適配體結(jié)合，之后再被水解，最終形成OTA的循環(huán)使用，釋放出越來(lái)越多的FAM熒光素，引起信號(hào)放大，從而實(shí)現(xiàn)有選擇性地靈敏檢測(cè)OTA。

2.2 適配體G-四鏈體結(jié)構(gòu)的表征

通過(guò)記錄圓二色光譜對(duì)FAM標(biāo)記的適配體DNA在不同條件下的構(gòu)象變化進(jìn)行表征(圖2)。結(jié)果顯示，加入OTA后(曲線b)，F(xiàn)AM標(biāo)記適配體的圓二色光譜在290 nm處呈現(xiàn)出較強(qiáng)的正峰，在265 nm附近呈現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)峰。這一現(xiàn)象由適配體中反向平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成引起[26]，而適配體與OTA的結(jié)合導(dǎo)致橢圓率增加。當(dāng)體系中脫氧核糖核酸酶Ⅰ存在時(shí)，由于脫氧核糖核酸酶Ⅰ對(duì)DNA鏈具有水解作用， G-四鏈體結(jié)構(gòu)被破壞，圓二色光譜圖隨之發(fā)生變化(曲線c)。

a.適配體；b.適配體+OTA；c.適配體+OTA+DNase Ⅰ。

2.3 方法的可行性驗(yàn)證

基于DNase Ⅰ輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大方式檢測(cè)赭曲霉毒素A方法的可行性驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，當(dāng)FAM標(biāo)記的適配體受到一定波長(zhǎng)的激發(fā)時(shí)，會(huì)在518 nm處檢測(cè)出熒光(曲線a)。而在氧化石墨烯存在的情況下，吸附在氧化石墨烯表面的適配體使得FAM到氧化石墨烯之間的距離縮短，產(chǎn)生FAM與氧化石墨烯之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，F(xiàn)AM的熒光被猝滅(曲線b)。作為本研究的猝滅劑，氧化石墨烯可以有效地猝滅FAM約89%的熒光。加入OTA后FAM的熒光得到恢復(fù)，熒光強(qiáng)度與沒(méi)有OTA的情況相比有所增強(qiáng)(曲線c)。上述過(guò)程中，OTA和適配體之間的強(qiáng)親和力具有關(guān)鍵作用，由于OTA適配體反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高，導(dǎo)致G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成阻止了FAM標(biāo)記的適配體吸附到氧化石墨烯表面。此外，在體系中DNase Ⅰ存在的情況下熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(曲線d)，信號(hào)強(qiáng)度約為無(wú)酶放大傳統(tǒng)策略的4倍。產(chǎn)成該現(xiàn)象的原因是：DNase Ⅰ催化的OTA適配體反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)復(fù)合物被破壞，目標(biāo)物OTA釋放，釋放的OTA與另一個(gè)吸附在氧化石墨烯表面的FAM標(biāo)記適配體結(jié)合，導(dǎo)致OTA分析物的循環(huán)利用和信號(hào)放大。上述結(jié)果表明，通過(guò)監(jiān)測(cè)適配體傳感平臺(tái)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)測(cè)量OTA濃度的方法可行。

a.適配體(50 nmol/L),b.適配體(50 nmol/L)+GO(3 μg/mL)/PVP(10 nmol/L),c.適配體(50 nmol/L)+GO(3 μg/mL)/PVP(10 nmol/L)+OTA(50 nmol/L),d.適配體(50 nmol/L)+GO(3 μg/mL)/PVP(10 nmol/L)+OTA(50 nmol/L)+DNase Ⅰ(50 U)。

2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 氧化石墨烯濃度的優(yōu)化

氧化石墨烯作為本方法的猝滅劑，其濃度非常重要。本研究比較了氧化石墨烯在質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8和10 μg/mL的情況下，不存在和存在OTA時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度比(圖4)。熒光強(qiáng)度比通過(guò)F/F0-1進(jìn)行計(jì)算，其中F0和F分別為不存在和存在250 nmol/L OTA時(shí)體系中加入各濃度氧化石墨烯后的熒光強(qiáng)度。一般來(lái)說(shuō)，使用的氧化石墨烯越多，越能有效地吸附單鏈DNA，猝滅效率越高；但過(guò)量的氧化石墨烯可能會(huì)包裹G-四鏈體DNA，也會(huì)猝滅熒光。因此，隨著氧化石墨烯質(zhì)量濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度比呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，氧化石墨烯質(zhì)量濃度為4 μg/mL時(shí)體系具有最優(yōu)熒光強(qiáng)度比。

圖4 不同氧化石墨烯質(zhì)量濃度下反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度比Fig.4 Fluorescence intensities and fluorescence intensity ratios ofthe reaction systems with different concentrations of graphene oxide

2.4.2 PVP濃度和分子量的優(yōu)化

PVP用量是影響OTA和氧化石墨烯之間非特異性吸附的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究了在氧化石墨烯質(zhì)量濃度為4 μg/mL的條件下，PVP溶液物質(zhì)的量濃度分別為0、5、10、25、50和100 nmol/L時(shí)，樣品的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)PVP濃度過(guò)高時(shí)，其在氧化石墨烯上吸附占據(jù)了過(guò)多的結(jié)合位點(diǎn)，阻止了FAM標(biāo)記的適配體與氧化石墨烯作用，降低了氧化石墨烯的猝滅效率(圖5a)。此外，PVP包被的氧化石墨烯還可以有效阻止目標(biāo)分子與氧化石墨烯之間的非特異性吸附。由熒光強(qiáng)度比的結(jié)果可以看出，PVP的最佳物質(zhì)的量濃度為10 nmol/L(圖5b)。

圖5 不同PVP物質(zhì)的量濃度下反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度比Fig.5 Fluorescence intensities and fluorescence intensity ratios of the reaction systems with different concentrations of PVP

實(shí)驗(yàn)還研究了使用不同分子量的PVP(8 000、24 000、58 000)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖6所示。可以看出，當(dāng)PVP的分子量為24 000時(shí)，熒光強(qiáng)度比值最高(圖6b)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇分子量為24 000的PVP作為實(shí)驗(yàn)材料。

圖6 不同分子量PVP條件下反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度比Fig.6 Fluorescence intensities and fluorescence intensity ratios of the reaction systems with different PVP molecular weights

2.4.3 DNase Ⅰ用量的優(yōu)化

為了使檢測(cè)體系的性能達(dá)到最佳，對(duì)DNase Ⅰ的活性進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯?，當(dāng)DNase Ⅰ活性較小時(shí)，無(wú)法將從氧化石墨烯表面脫落下來(lái)的游離G-四鏈體DNA完全水解，產(chǎn)生的熒光信號(hào)較低。隨著DNase Ⅰ活性的增加，越來(lái)越多的G-四鏈體DNA被水解，熒光強(qiáng)度急劇增加。當(dāng)DNase Ⅰ活性增加至40 U時(shí)，熒光強(qiáng)度基本達(dá)到平臺(tái)期。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DNase Ⅰ的活性選擇40 U。

圖7 DNase Ⅰ活性對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of DNase Ⅰ activities on the fluorescence intensities of the reaction system

2.4.4 孵育時(shí)間的優(yōu)化

為了獲得最適宜的孵育時(shí)間，對(duì)體系中加入DNase Ⅰ后的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖8所示。加入DNase Ⅰ后分別令體系反應(yīng)5、10、20、30、40、50、60、70和80 min，記錄測(cè)量得到的熒光強(qiáng)度。可以看出，熒光強(qiáng)度在反應(yīng)初始階段急劇增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至40 min時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。此后孵育時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度不再繼續(xù)增加，推測(cè)40 min時(shí)FAM修飾的適配體與靶分子之間的特異性結(jié)合達(dá)到飽和。因此，選擇DNase Ⅰ的作用時(shí)間為40 min。

圖8 DNase Ⅰ作用時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of incubation times of DNase Ⅰ on thefluorescence intensities of the reaction system

2.5 方法的可行性

將FAM修飾的適配體與OTA提前混合，保證二者之間作用充分。圖9a為熒光強(qiáng)度對(duì)OTA物質(zhì)的量濃度的響應(yīng)情況，可以看出熒光強(qiáng)度隨著OTA物質(zhì)的量濃度(0～5 μmol/L)的增加而增強(qiáng)。將圖9a中熒光光譜的最大發(fā)射峰強(qiáng)度繪制為OTA物質(zhì)的量濃度的函數(shù)(圖9b)，得到OTA的線性檢測(cè)范圍為25～250 nmol/L，回歸方程為y=1.667 9x+39.133 9(R2=0.994)，計(jì)算出的OTA檢測(cè)限(LOD)為9.38 nmol/L(信噪比為3)。

圖9 熒光強(qiáng)度對(duì)OTA濃度的響應(yīng)情況Fig.9 Response of fluorescence intensities to OTA concentrations

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用EWA生物傳感平臺(tái)，或者使用納米石墨材料或單壁碳納米管(SWCNHs)作為體系的熒光猝滅劑，其OTA檢測(cè)體系的LOD值結(jié)果如表1所示。比較發(fā)現(xiàn)，本方法的檢測(cè)限低于先前沒(méi)有使用DNase Ⅰ檢測(cè)方法的檢測(cè)限。例如，在利用EWA生物傳感平臺(tái)檢測(cè)OTA的方法中，其LOD值為975 nmol/L[27]。這主要是由于本方法中DNase Ⅰ的有效催化活性實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，產(chǎn)生了信號(hào)放大的效果。

表1 本方法與其他OTA檢測(cè)方法檢測(cè)限的比較Tab.1 LOD comparison with other OTA detection methods

2.6 方法的特異性

為了評(píng)估構(gòu)建的酶輔助信號(hào)放大熒光法對(duì)靶標(biāo)毒素OTA的選擇特異性，選擇OTA結(jié)構(gòu)類似物OTB、OTC、華法林和真菌毒素ZEN作為干擾物質(zhì)分別加入檢測(cè)體系，使體系中毒素的物質(zhì)的量濃度為250 nmol/L，監(jiān)測(cè)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的變化情況，結(jié)果如圖10所示?？梢钥闯?，只有當(dāng)靶標(biāo)毒素OTA存在時(shí)體系才會(huì)產(chǎn)生非常顯著的熒光特異性響應(yīng)，OTA的結(jié)構(gòu)類似物OTB、OTC、華法林和真菌毒素ZEN不會(huì)引起體系熒光強(qiáng)度的明顯增加，表明該熒光分析法對(duì)靶標(biāo)毒素 OTA具有良好的選擇特異性。

圖10 OTA檢測(cè)體系的選擇特異性Fig.10 Selectivity of the sensor toward OTA

2.7 方法的有效性

為了驗(yàn)證該方法的可靠性，在紅葡萄酒和2種咖啡樣品中添加4 種不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用構(gòu)建好的酶輔助信號(hào)放大熒光法測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度， 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品的OTA濃度(圖11)，進(jìn)而確定該方法對(duì)紅葡萄酒和咖啡樣品中不同濃度OTA的加標(biāo)回收率和精密度。將本方法的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)HPLC方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較(表2)，可以看出本方法具有良好的有效性，回收率為96.78%～110.97%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%～5.00%，適用于實(shí)際樣品中OTA的檢測(cè)。

圖11 使用本方法得到的OTA樣品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11 Linear relationships between fluorescence intensities and the concentrations of OTA using the constructed method

表2 方法的回收率和精密度測(cè)定結(jié)果Tab.2 The recovery rate and precision of the method

3 結(jié)論

研究提出一種基于DNase Ⅰ酶輔助的目標(biāo)物循環(huán)信號(hào)放大策略用于樣品中OTA的檢測(cè)。該方法利用了氧化石墨烯和靶標(biāo)適配體的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合DNase Ⅰ的水解作用實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，達(dá)到了信號(hào)放大的目的。通過(guò)考察氧化石墨烯濃度、PVP濃度及分子量、DNase Ⅰ活性和孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)OTA的影響，獲得了最佳檢測(cè)條件。該方法在OTA物質(zhì)的量濃度為25～250 nmol/L的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與樣品中OTA濃度之間具有良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為9.38 nmol/L，回收率為96.78%～110.97%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%～5.00%，對(duì)紅酒、白咖啡和速溶咖啡等實(shí)際樣品中的OTA檢測(cè)均具有較好效果。本研究構(gòu)建的方法操作簡(jiǎn)便，選擇性和可靠性好，可用于樣品中OTA的檢測(cè)，并為食品中其他真菌毒素的檢測(cè)提供了新思路。