磷脂聚合物涂層對聚丙烯膜氧合器血液相容性的影響

史珂慧，王彥兵，劉雯雁，張 歡，高菊林，宮永寬，蔣紅利*

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎臟病醫(yī)院血液凈化科，陜西 西安 710061；2 西安工程大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院，功能性紡織材料及制品教育部重點實驗室，陜西 西安 710048；3 西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，合成與天然功能分子教育部重點實驗室，陜西 西安 710127)

氧合器是體外循環(huán)(extracorporeal circulation, ECC)設(shè)備中的核心元件，其主要組成部分是膜材料，而膜材料的血液相容性是氧合器應(yīng)用中最值得關(guān)注的問題。在ECC過程中，膜材料接觸血液后表面會瞬間吸附血漿蛋白，激活凝血系統(tǒng)引起凝血，并進(jìn)一步激活補體和白細(xì)胞誘發(fā)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，這既導(dǎo)致頻繁更換耗材的醫(yī)療費用增加，又加大了患者的死亡風(fēng)險[1]。在體外循環(huán)中使用抗凝劑是提高血液相容性的一個常規(guī)措施，這雖然可以減少凝血事件的發(fā)生，但增加了出血的風(fēng)險，而且長期使用肝素類抗凝劑還會引起脂質(zhì)代謝紊亂、骨質(zhì)疏松及肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥等不良反應(yīng)，對患者的長期生存具有嚴(yán)重影響[2]。

對膜材料表面進(jìn)行改性是提高氧合器血液相容性的另一個重要策略。比較簡單的改性方法是在膜表面構(gòu)建一層生物相容性涂層以減少血漿蛋白的吸附，進(jìn)而減少凝血反應(yīng)和免疫反應(yīng)。2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, MPC)聚合物是一類含有磷酰膽堿基團(tuán)的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)聚合物。研究表明，將MPC聚合物涂敷在材料表面不僅可以明顯減少血漿蛋白的吸附，而且其只在材料表面局部作用，不會對機體造成嚴(yán)重影響，因此MPC聚合物近些年來備受關(guān)注[3-5]。盡管MPC聚合物已被用于導(dǎo)絲、血管支架等醫(yī)療器械的表面改性，但其長期使用效果還需要進(jìn)一步持續(xù)觀察[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，對體外循環(huán)設(shè)備進(jìn)行MPC聚合物涂層改性并不能改善體外循環(huán)設(shè)備引起的炎癥反應(yīng)[9]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是MPC聚合物涂層以簡單的物理吸附結(jié)合在膜表面，在體內(nèi)會溶解或脫落而無法發(fā)揮作用。一些體外實驗顯示，在MPC聚合物中加入交聯(lián)基團(tuán)或多巴胺可以增加聚合物涂層的黏附性[10-13]，但是這些MPC聚合物涂層很少被用于體外循環(huán)膜材料的改性，其在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中是否依然具有優(yōu)異的穩(wěn)定性并不清楚。

本研究基于上述思路進(jìn)行體外循環(huán)膜材料的改性研究，通過合成含有交聯(lián)基團(tuán)的PMBT(MPC/甲基丙烯酸正丁酯(BMA)/γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基(TSMA))聚合物、PMLT(MPC/甲基丙烯酸十二烷基酯(LMA)/TSMA/丙烯酸聚乙二醇酯(PEG))聚合物和含有多巴胺的PMNC(MPC/對硝基苯氧羰基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(NPEM)/多巴胺)聚合物，并將這3種MPC聚合物分別涂敷在聚丙烯(polypropylene，PP)膜材料表面，研究聚合物涂層的穩(wěn)定性及其對PP膜氧合器的血液相容性，以期找到生物穩(wěn)定性優(yōu)異且可以提高ECC膜材料血液相容性的涂層材料，并為其進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供客觀的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MPC聚合物的合成

使用自由基聚合方式合成PMBT聚合物。該聚合物中含有可交聯(lián)基團(tuán)三甲氧基硅烷，合成方法參照文獻(xiàn)[14]。簡述如下：在反應(yīng)器中加入1/3體積的乙醇，通入氮氣30 min，將反應(yīng)器加熱至75 ℃。把單體MPC、BMA和TSMA溶解在剩下的2/3體積的乙醇中，將偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)劑溶于少量四氫呋喃(THF)溶劑中。取1/3體積的AIBN+THF混合溶液至反應(yīng)器；取2/3體積的AIBN+THF混合溶液與單體溶液混合，并將其用恒壓滴液漏斗等速加入反應(yīng)器中，滴加時間為1～2 h，75 ℃攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液濃縮，然后使用無水乙醚沉淀，沉淀物溶解在無水甲醇中保存或真空干燥保存。

用同樣方法合成含PEG和可交聯(lián)基團(tuán)的PMLT聚合物。參照Gong等[13]的方法合成含多巴胺的PMNC聚合物。

1.2 MPC聚合物涂層的構(gòu)建

1.2.1 PMBT聚合物涂層的構(gòu)建

采用溶液浸漬法對PP膜材料樣品進(jìn)行改性。具體步驟如下：將PMBT聚合物溶于體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇溶液，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的PMBT聚合物甲醇溶液；將PP膜浸泡在上述溶液中5 min，50 ℃三乙胺密閉環(huán)境氛圍交聯(lián)8 h，蒸餾水洗滌，真空干燥備用。

PP膜氧合器改性方法如下：將1 mg/mL PMBT甲醇溶液注入氧合器浸涂10 min，除去聚合物溶液并干燥；室溫下三乙胺氣氛密閉貯存5 d，然后用大量蒸餾水洗滌，真空干燥，環(huán)氧乙烷消毒后備用。

1.2.2 PMLT聚合物涂層的構(gòu)建

PP膜材料改性方法如下：將PMLT聚合物溶于蒸餾水配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的PMLT聚合物水溶液；將PP膜在上述溶液中浸泡2 h，80 ℃加熱交聯(lián)24 h，蒸餾水洗滌，真空干燥備用。

PP膜氧合器改性方法如下：將1 mg/mL PMLT聚合物水溶液注入氧合器，浸涂2 h，抽出溶液后80 ℃加熱干燥24 h，蒸餾水洗滌后真空干燥，環(huán)氧乙烷消毒后備用。

1.2.3 PMNC聚合物涂層的構(gòu)建

配置1 mg/mL的PMNC聚合物水溶液，用飽和碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)至8.5；將PP膜在上述溶液中浸泡2 h，80 ℃加熱交聯(lián)8 h，蒸餾水洗滌，真空干燥備用。PP膜氧合器改性方法同PMLT聚合物涂層。

1.3 MPC聚合物涂層的結(jié)構(gòu)表征

采用INOVA-400液體超導(dǎo)核磁共振譜儀測試MPC聚合物的1H-NMR譜圖；采用K-Alpha型光電子能譜儀分析改性前后PP膜表面的X射線光電子能譜(XPS)；采用Tensor 27傅里葉紅外光譜儀對改性前后的PP膜進(jìn)行衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)測定。

1.4 MPC聚合物涂層的生物穩(wěn)定性評估

在20 ℃或60 ℃條件下，將改性后的PP膜樣品分別置于體積分?jǐn)?shù)為0、50%和90%的乙醇溶液中浸泡12 h，或放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中超聲波洗滌30 min。將樣品用蒸餾水完全洗脫并干燥，測試樣品的動態(tài)接觸角，觀察處理前后改性PP膜的動態(tài)接觸角變化。

1.5 改性PP膜的體外血液相容性評價

1.5.1 體外蛋白質(zhì)吸附實驗

將PP膜樣品分別浸入4.5 mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液和0.3 mg/mL纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，置于SDS水溶液中進(jìn)行超聲波洗滌。取少量解吸液加入二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)工作試劑，紫外分光光度計測定溶液在562 nm處的吸光度值，代入事先繪制的蛋白質(zhì)工作曲線，計算得出解析液中的蛋白質(zhì)濃度，并計算蛋白質(zhì)在樣品上的吸附量。

1.5.2 血小板黏附實驗

PP膜樣品在磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡120 min，濾紙吸除殘余的PBS溶液；將20 μL富含血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)加入待測樣品，置于培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿在37 ℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育120 min，用PBS溶液沖洗樣品表面，將黏附力弱的血小板淋洗干凈；樣品在2.5%戊二醛溶液中浸泡60 min，依次用PBS溶液和蒸餾水洗滌，-50 ℃凍干120 min；噴金后用掃描電鏡(SEM)觀察血小板的形態(tài)及黏附情況。

1.6 動物體內(nèi)實驗評價氧合器的血液相容性

本研究經(jīng)西安交通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行，采用交叉實驗的方法，洗脫期為14 d。

1.6.1 ECC動物模型的建立

動物模型采用6只實驗用比格犬，體重為9～12 kg。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)后仰臥位固定，然后經(jīng)股靜脈留置雙腔中心靜脈導(dǎo)管(8.5 Fr)。160 mL羥乙基淀粉注射液預(yù)充管路及透析器后，在壓力泵的作用下血液從導(dǎo)管動脈端引出并流經(jīng)氧合器，再經(jīng)導(dǎo)管靜脈端回輸入犬體內(nèi)。ECC時間為120 min，血流速度為90 mL/min，抗凝方式為枸櫞酸鈉體外抗凝。具體抗凝操作為4%枸櫞酸鈉在氧合器前以180 mL/h的速度持續(xù)泵入，同時經(jīng)外周靜脈補充葡萄糖酸鈣溶液。ECC結(jié)束后拔除股靜脈插管并按壓傷口直至不再滲血。如果在ECC過程中有部分凝血則提前結(jié)束。

1.6.2 血液檢測

分別于體外循環(huán)0 min、5 min、15 min、30 min、60 min及120 min時采集血樣，檢測血液中血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞(RBC)的計數(shù)以及FIB、β血小板球蛋白(β-TG)、白介素8(IL-8)、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TAT)、補體片段5a(C5a)和凝血酶原片段F1+2(F1+2)的濃度。使用全自動細(xì)胞計數(shù)儀和凝血分析儀進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)和纖維蛋白原檢測，采用酶聯(lián)免疫分析實驗(ELISA)檢測血漿中β-TG、IL-8、C5a、TAT和F1+2的濃度。

1.6.3 PP膜表面凝血情況觀察

ECC結(jié)束后，用2 000 mL生理鹽水沖洗整個管路及氧合器，解剖氧合器并將PP膜浸泡在2.5%戊二醛溶液中，然后用去離子水沖洗3次，-50 ℃將PP膜冷凍干燥，采用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察膜表面并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MPC聚合物合成結(jié)構(gòu)

2.1.1 PMBT聚合物合成結(jié)構(gòu)

PMBT聚合物的1H-NMR譜圖如圖1所示，可以看到PMBT各組分的特征峰，即MPC特征峰(3.25)、BMA特征峰(1.45)和TSMA特征峰(0.65)。

圖1 PMBT聚合物的1H-NMR譜圖 Fig.1 1H-NMR spectrum of PMBT polymer

2.1.2 PMLT聚合物合成結(jié)構(gòu)

PMLT聚合物的1H-NMR譜圖如圖2所示，可以看到PMLT各組分的特征峰，即MPC特征峰(3.25)、LMA特征峰(1.4)、PEG特征峰(3.7)和TSMA特征峰(0.65)。

圖2 PMLT聚合物的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectrum of PMLT polymer

2.1.3 PMNC聚合物合成結(jié)構(gòu)

PMNC聚合物的1H-NMR譜圖及聚合物中各組分的組成比例同Gong等[13]。

2.2 MPC聚合物薄膜的形貌與組成

用SEM、XPS和ATR-FTIR對PP膜材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以PMBT聚合物改性PP膜為例對表征結(jié)果進(jìn)行說明。SEM結(jié)果顯示無涂層PP膜具有直徑約為1 μm的微孔，而改性PP膜表面覆蓋了一層薄薄的PMBT聚合物膜(圖3)。用ATR-FTIR

圖3 PP膜改性前后的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM photos of PP membranes before and after modification

分析改性PP膜表面的官能團(tuán)，可以發(fā)現(xiàn)PMBT聚合物所特有的信號峰，即在1 750 cm-1處呈現(xiàn)C=O拉伸振動，1 240 cm-1和1 080cm-1處呈現(xiàn)O～P=O不對稱及對稱拉伸振動；而無涂層PP膜中沒有檢測到上述信號峰(圖4a)。XPS結(jié)果顯示PMBT改性PP膜后，譜中出現(xiàn)了P、N和Si等 PMBT聚合物所特有的信號峰，而無涂層PP膜上沒有出現(xiàn)類似信號峰(圖4b)。以上結(jié)果均表明PMBT聚合物被成功地涂敷在PP膜表面。

圖4 PMBT改性PP膜的ATR-FTIR和XPS結(jié)果Fig.4 ATR-FTIR and XPS results of PMBT modified PP membranes

PMLT和PMNC聚合物改性PP膜的上述分析結(jié)果與PMBT聚合物改性PP膜類似，也表明PMLT和PMNC聚合物分別被成功地涂敷在PP膜表面。

2.3 MPC聚合物涂層的生物穩(wěn)定性

動態(tài)接觸角的變化可以反映MPC聚合物涂層的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，在20 ℃或60 ℃條件下，將膜材料分別在體積分?jǐn)?shù)0、50%和90%的乙醇溶液中浸泡12 h，或者在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS溶液中超聲波洗滌30 min，PMBT、PMLT、PMNC聚合物改性PP膜的動態(tài)接觸角均沒有發(fā)生明顯變化(P>0.05)(圖5)。以上結(jié)果說明，在乙醇溶液及SDS溶液中，3種MPC聚合物涂層非常穩(wěn)定，沒有被溶解或洗脫。

圖5 MPC改性PP膜在乙醇/SDS溶液中浸泡前后的動態(tài)接觸角變化Fig.5 Dynamic contact angle changes of MPC modified PP membranes before and after immersion in ethanol/SDS solution

2.4 抗蛋白質(zhì)吸附性能

如圖6所示，分別在4.5 mg/mL BSA溶液和0.3 mg/mL FIB溶液中浸泡120 min后，無涂層PP膜吸附的BSA和FIB分別為(0.51±0.14) μg/mg和(0.80±0.20) μg/mg。PMBT聚合物涂層PP膜的BSA和FIB吸附量較無涂層PP膜分別下降了78%和79%，僅為(0.11±0.04) μg/mg和(0.17±0.08) μg/mg。PMNC聚合物涂層PP膜吸附的BSA和FIB分別為(0.22±0.04) μg/mg和(0.18±0.06) μg/mg，與無涂層PP膜相比分別減少了57%和78%。PMLT聚合物涂層改性使PP膜對BSA和FIB的吸附量分別降至(0.13±0.06) μg/mg和(0.22±0.05) μg/mg，與無涂層PP膜相比分別減少了75%和73%。PMBT、PMLT、PMNC聚合物涂層組分別與無涂層組兩兩比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，但3種MPC聚合物涂層組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

**表示PMBT組、PMNC組、PMLT組與無涂層組比較差異顯著(P<0.01)。圖6 MPC改性PP膜對BSA和FIB的吸附Fig.6 Adsorption of BSA and FIB by MPC modified PP membranes

2.5 抗血小板黏附性能

電鏡下觀察正常未活化的血小板呈圓盤狀，而活化的血小板腫脹變形，失去原有結(jié)構(gòu)。如圖7所示，無涂層PP膜表面黏附的血小板較多且呈活化狀態(tài)，有些表現(xiàn)為局部腫脹，有些表現(xiàn)為星形不規(guī)則狀，周邊可見偽足。相比之下，3種MPC聚合物涂層PP膜表面黏附的血小板數(shù)量均很少， 尤其是PMBT涂層PP膜表面，幾乎看不到血小板黏附；雖然PMNC涂層PP膜表面可以觀察到少量黏附的血小板，但是均為球形或圓盤形等非活化狀態(tài)。

圖7 MPC改性PP膜黏附血小板的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.7 SEM photos of adhesion to platelets for MPC modified PP membranes

2.6 體外循環(huán)下氧合器改性涂層的抗血栓效果

體外循環(huán)120 min后，無涂層氧合器中可見較多紅色血栓形成，而MPC聚合物涂層氧合器中幾乎沒有血栓形成(圖8)。將氧合器解剖后，可以看到無涂層PP膜表面有紅色血栓形成，而3種MPC聚合物涂層PP膜表面幾乎看不到血栓(圖8)。以上結(jié)果表明，MPC聚合物涂層可以顯著改善PP膜表面的凝血現(xiàn)象。

2.7 體外循環(huán)后改性PP膜的微觀形貌

如圖9a所示，在光學(xué)顯微鏡下觀察無涂層PP膜表面，可見明顯血栓形成；在低倍SEM下可見無涂層PP膜表面覆蓋了一層血栓；在高倍SEM下可以看到無涂層PP膜表面有一層含血細(xì)胞、纖維蛋白原等成分的復(fù)合涂層，形成了厚而不規(guī)則的網(wǎng)狀污染層結(jié)構(gòu)，使大部分微孔被堵塞。但是PMBT、PMLT、PMNC聚合物涂層PP膜均保持了原有的聚合物涂層狀態(tài)，對血液成分的吸附較少，亦沒有明顯的血栓形成(圖9b、9c、9d)。

a. 無涂層氧合器可見明顯紅色血栓形成；b.MPC聚合物涂層氧合器；c. 無涂層PP膜；d. PMBT涂層PP膜； e. PMNC涂層PP膜； f. PMLT涂層PP膜。

圖9 體外循環(huán)120 min后氧合器表面改性膜的顯微鏡照片F(xiàn)ig.9 Micrographs of modified membranes atoxygenator surface after 120 min of ECC

2.8 體外循環(huán)后的血液組成變化

2.8.1 纖維蛋白原吸附與凝血激活

在ECC過程中，預(yù)充液進(jìn)入動物體內(nèi)會對血液起到稀釋作用，根據(jù)實驗犬體質(zhì)量(12 kg)和理論血容量(7%)計算血液稀釋率約為16%。

如圖10a所示，ECC 5 min時各組的FIB質(zhì)量濃度均較ECC前有所下降。除去血液稀釋效應(yīng)，無涂層組和PMNC組的FIB質(zhì)量濃度分別下降約15%和18%，而PMBT組和PMLT組幾乎沒有下降。ECC 15 min時，PMBT組、PMNC組和PMLT組的FIB質(zhì)量濃度下降逐漸減緩并達(dá)到平臺期，但是無涂層組的FIB質(zhì)量濃度繼續(xù)下降。ECC 120 min時，無涂層組的FIB質(zhì)量濃度僅為(0.63±0.05) g/L，較ECC前下降70%；而PMBT組、PMNC組和PMLT組的FIB質(zhì)量濃度分別為(1.90±0.42) g/L、(1.48±0.35) g/L和(1.80±0.04) g/L，較ECC前分別下降15%、22%和12%，下降幅度比無涂層組分別低55%、48%和58%。

如圖10b、10c所示，體外循環(huán)時各組的TAT和F1+2濃度均有所上升，其中無涂層組的上升趨勢最為明顯。ECC 120 min時，無涂層組的TAT質(zhì)量濃度和F1+2物質(zhì)的量濃度均達(dá)到峰值，分別為(7.05±0.10) μg/L和(99.56±8.49) nmol/L，分別是ECC前的2.59倍和2.78倍。無涂層組TAT質(zhì)量濃度與PMBT組、PMNC組、PMLT組兩兩比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，P<0.05，P<0.05)；而各組的F1+2物質(zhì)的量濃度比較無差異(P>0.05)。MPC聚合物各組的TAT和F1+2濃度在各ECC時間點比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

*和**表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有差異(P<0.05，P<0.01)，***表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有顯著性差異(P<0.001)。

2.8.2 血小板吸附與激活

如圖11a所示，ECC 5 min時，各組的PLT計數(shù)均較ECC前有所下降，其中無涂層組的PLT計數(shù)百分比下降最為明顯(38.3%)，PMBT組、PMNC組和PMLT組的PLT計數(shù)百分比分別下降6.6%、7.3%和20.9%。值得注意的是，EEC 120 min時，PMBT組和PMLT組的PLT計數(shù)已基本恢復(fù)到ECC前水平，而PMNC組和無涂層組的PLT計數(shù)較ECC前分別下降20%和33%。PMBT組、PMLT組與無涂層組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，但PMNC組與無涂層組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，各MPC聚合物涂層組之間亦沒有差異(P>0.05)。

如圖11b所示，無涂層組在ECC 5 min時的β-TG質(zhì)量濃度開始增加，15～30 min期間上升明顯，60 min后上升趨勢逐漸減緩；而PMBT組、PMNC組和PMLT組的β-TG質(zhì)量濃度ECC前后無明顯變化。各MPC聚合物涂層組與無涂層組比較均有顯著性差異(P<0.001)。

2.8.3 白細(xì)胞吸附與激活

如圖12a所示，ECC 5 min時，各組的WBC計數(shù)均較ECC前有所下降，無涂層組、PMBT組、PMNC組和PMLT組的WBC下降率分別為36.3%、14.1%、20.9%和2.4%(除去血液稀釋16%)，雖然各組間比較無明顯差異，但無涂層組的下降趨勢最為明顯。值得注意的是，ECC 120 min時，PMBT組、PMLT組和無涂層組的WBC計數(shù)均有所恢復(fù)，而PMNC組的WBC計數(shù)繼續(xù)下降，但是與其他組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

*和**表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有差異(P<0.05，P<0.01)，***表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有顯著性差異(P<0.001)。

如圖12b、12c所示，ECC過程中無涂層組的C5a和IL-8質(zhì)量濃度上升明顯，15 min時達(dá)到峰值，分別是ECC前的4.24倍和5.65倍；120 min時，無涂層組的C5a和IL-8質(zhì)量濃度基本恢復(fù)到ECC前水平。各MPC聚合物涂層組的C5a和IL-8質(zhì)量濃度在ECC過程中始終維持在比較穩(wěn)定的水平，與無涂層組比較均有顯著性差異(P<0.05)，各MPC聚合物涂層組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

**表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有差異(P<0.01)，***表示MPC聚合物涂層組和無涂層組比較有顯著性差異(P<0.001)。

2.8.4 紅細(xì)胞及血紅蛋白指標(biāo)變化情況

在整個ECC過程中，各組的紅細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白百分比、平均紅細(xì)胞體積等相關(guān)指標(biāo)均無明顯變化，組間比較亦無差異(圖13)，說明MPC聚合物涂層不會增加紅細(xì)胞消耗，不會引起溶血，安全性好。

RBC表示紅細(xì)胞，HCT表示紅細(xì)胞壓積，HGB表示血紅蛋白，MCV表示平均紅細(xì)胞體積，MCH表示平均血紅蛋白含量，RDW-CV表示紅細(xì)胞寬度CV值。

3 討論

目前的膜材料均具有血液不相容性，膜材料表面改性是提高其血液相容性的重要策略。MPC聚合物是一類仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的磷脂聚合物，研究表明MPC聚合物涂層可以顯著提高膜材料的血液相容性。然而，既往MPC聚合物涂層在體內(nèi)的不穩(wěn)定性限制了其臨床應(yīng)用[3-5, 15]。為了提高M(jìn)PC聚合物的穩(wěn)定性，本研究合成了含交聯(lián)基團(tuán)的PMBT聚合物、PMLT聚合物和含多巴胺的PMNC聚合物，并將這3種MPC聚合物分別涂敷在PP膜表面。通過體外、體內(nèi)序貫性實驗，發(fā)現(xiàn)3種MPC聚合物不僅具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，而且能夠顯著提高PP膜氧合器的血液相容性，明顯減少體外循環(huán)凝血和機體炎癥反應(yīng)。該研究結(jié)果為MPC聚合物涂層醫(yī)療耗材的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了客觀的實驗依據(jù)。

MPC聚合物涂層的穩(wěn)定性是將其應(yīng)用于血液接觸設(shè)備的決定因素。該類涂層所使用的共聚物屬于類表面活性劑，容易在長期使用過程中發(fā)生脫落，相關(guān)研究表明表面活性劑涂層在4 h心胸旁路循環(huán)后只能保存90%[15]。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是MPC聚合物涂層以簡單的物理吸附結(jié)合在膜表面，在體內(nèi)會被溶解或脫落致其無法發(fā)揮作用。另外，在一定條件下，涂層表面附近的親水基團(tuán)可能發(fā)生遷移而深入薄膜內(nèi)部，引起表面不可逆的結(jié)構(gòu)變化[16]。因此，如何增加MPC聚合物的穩(wěn)定性成為研究熱點。Lewis等[10]將交聯(lián)基團(tuán)引入MPC聚合物，結(jié)果表明MPC聚合物通過三甲氧基硅烷交聯(lián)固定在基材表面，可以明顯提高M(jìn)PC聚合物涂層的穩(wěn)定性。Gong等[11]利用自由基共聚合合成了一種含交聯(lián)基團(tuán)的MPC聚合物(PMST聚合物)，發(fā)現(xiàn)這種方法可以在很大程度上調(diào)整聚合物的表面結(jié)構(gòu)，獲得一個穩(wěn)定的細(xì)胞外膜模擬表面/界面。此外，把多巴胺加入MPC聚合物中可以合成具有仿細(xì)胞膜和仿貽貝結(jié)構(gòu)的“雙仿生”聚合物，該類聚合物不僅具有良好的抗蛋白吸附性能，而且黏附性極強，在生物醫(yī)學(xué)、材料工程、生物工程和環(huán)境應(yīng)用等方面擁有廣泛的應(yīng)用前景[13, 17-20]。本研究合成的3種MPC聚合物包括含交聯(lián)基團(tuán)的PMBT聚合物、PMLT聚合物以及含多巴胺的PMNC聚合物，體外實驗和體外循環(huán)動物模型發(fā)現(xiàn)3種MPC聚合物在體內(nèi)外均具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，與上述研究結(jié)果吻合。

膜材料在接觸血液后纖維蛋白原是最早沉積的蛋白質(zhì)之一，吸附的纖維蛋白原發(fā)生構(gòu)象變化后可以介導(dǎo)血小板、白細(xì)胞和補體的黏附與活化，激活凝血反應(yīng)、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，因此纖維蛋白吸附率是評價膜材料血液相容性的關(guān)鍵指標(biāo)[1, 21-23]。本研究表明，在體外實驗中PMBT、PMLT和PMNC聚合物涂層均能降低PP膜表面對BSA和FIB的吸附，該結(jié)果與另一個MPC聚合物PMB30的研究結(jié)果類似，而PMB30是第一個被評價為血液相容性良好的MPC聚合物，并已在美國食品和藥物管理局(FDA)注冊[24-26]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)ECC 120 min時，無涂層組的FIB濃度較ECC前下降約70%，而PMBT組、PMNC組和PMLT組的FIB濃度較ECC前僅下降了15%、22%和12%。在另一項研究中，含磷脂聚合物涂層的氧合器體外循環(huán)100 min后，F(xiàn)IB下降率約為38%[27]。與上述改性氧合器相比，PMBT、PMNC和PMLT聚合物涂層改性氧合器對FIB的吸附率更低。然而，蛋白吸附率只是評價血液相容性的指標(biāo)之一，還需要檢測更多指標(biāo)以對血液相容性進(jìn)行更全面的評價。

不同聚合物的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性存在差異，導(dǎo)致不同聚合物涂層與同一膜材料之間的相互作用也不同。在本研究中，PMBT、PMLT和PMNC聚合物涂層的體外穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)吸附無明顯差異。但在ECC過程中，PMNC組的WBC和PLT計數(shù)始終呈下降趨勢，而PMBT組和PMLT組的WBC和PLT計數(shù)呈現(xiàn)先降后升的趨勢；ECC 120 min時，PMBT組和PMLT組的WBC和PLT計數(shù)已基本恢復(fù)到ECC前水平，PMNC組卻明顯低于ECC前水平。雖然以上結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，但是推測造成這種現(xiàn)象的原因是PMNC涂層具有吸附力極強的雙仿生結(jié)構(gòu)，在膜材料接觸血液后，PMNC涂層膜表面吸附的WBC和PLT比其他聚合物涂層膜更多，從而造成血液循環(huán)中WBC和PLT計數(shù)下降，該推測還需要大量的體內(nèi)外實驗進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究通過體內(nèi)外實驗初步揭示了合成的3種仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)聚合物涂層PMBT、PMLT和PMNC可以抑制PP膜表面對纖維蛋白原的吸附，減少膜表面對血小板、補體和白細(xì)胞的黏附與活化，顯著提高PP膜氧合器的血液相容性，而且3種涂層均表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。上述研究結(jié)果為PMBT、PMLT和PMNC聚合物涂層體外循環(huán)醫(yī)療耗材的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了客觀的實驗依據(jù)。