miR-103對牙髓干細胞增殖及其向成牙本質(zhì)細胞分化的影響

李鳳月 齊洪光 于登臣 袁佳運 侯寶華

牙髓再生、自體牙再造等再生醫(yī)學研究在牙體牙髓病領(lǐng)域中得到了廣泛關(guān)注，而作為“種子細胞”的牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)成為近年來的研究熱點[1-2]。目前,對DPSCs增殖、分化等生物學特性的調(diào)控機制尚不完全清楚，牙體牙髓領(lǐng)域的再生醫(yī)學研究仍處于初級階段[3]。因此，深入研究DPSCs的增殖與分化等生物學行為的調(diào)控機制具有重要意義。近年來， miR-103對DPSCs的作用尚不清楚。本研究通過從成人第三磨牙中分離培養(yǎng)DPSCs，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)在DPSCs中過表達及降低miR-103的含量，繼而檢測miR-103對DPSCs增殖及分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

澳洲胎牛血清、低糖的DMEM細胞培養(yǎng)基、I型膠原及雙抗等細胞培養(yǎng)試劑(Gibco公司，美國)；轉(zhuǎn)染試劑lipo2000(Invitrogen公司，美國)；miRNA核苷酸序列(南京舟達公司)；q-PCR試劑套裝(RNA的提純、反轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒)(Takara公司，日本)；q-PCR引物(上海生工生物公司)；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(上海碧云天公司)；Runx2和Osx等抗體(Abcam公司，英國)；茜素紅、地塞米松、維生素C和磷酸甘油(Sigma公司，美國)；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及離心管(Corning公司，美國)； 實時熒光定量PCR儀(ABI7500fast,Applied Biosystems公司，美國)；酶標儀(SPS5845,上海沛歐分析儀器有限公司)；顯微鏡(cx21fs1,Olympus公司，日本)；電泳儀(天能EPS600, 上海天能公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 從成人第三磨牙中分離DPSCs，方法如下：所用牙齒均來自因阻生或因正畸治療需要而拔出的健康第三磨牙。第三磨牙拔出后進行徹底消毒，用含有青霉素及鏈霉素的清洗液浸泡后用環(huán)鉆劈開，無菌條件下取出牙髓組織，并將上述組織修剪成約1 mm3的組織塊，用I型膠原酶完全覆蓋消化組織，短暫反應后，將消化后的組織塊置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于常規(guī)孵箱中培養(yǎng)，隔天置換培養(yǎng)基，待DPSCs從組織塊中爬出。待細胞融合率在70%左右時進行細胞傳代，取3～8 代的細胞用于實驗[4]。

利用lipo2000將公司合成的80 nmol/L的miRNA相關(guān)核苷酸序列轉(zhuǎn)染進DPSCs。本實驗根據(jù)轉(zhuǎn)染入細胞的核苷酸序列不同，將細胞分為對照組(Control)、miRNA陰性對照組(miR-NC)、miR-103過表達組(miR-mimic)和miR-103降低表達組(anti-miR)[5]。

1.2.2 茜素紅染色 完成細胞轉(zhuǎn)染后，利用75%乙醇固定培養(yǎng)皿中的DPSCs，利用雙蒸水沖洗細胞3 次，每孔加入40 mmol/L的茜素紅染料浸沒，染色10 min后清洗染料，并再次利用雙蒸水緩慢沖洗培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中加入緩沖液后繼續(xù)室溫孵育， 30 min后觀察紅色的礦化結(jié)節(jié)。采用梯度稀釋法制作茜素紅-吸光度標準曲線，進行半定量檢測[6]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測

在利用合成的核苷酸轉(zhuǎn)染細胞后，利用q-PCR技術(shù)檢測每組細胞miR-103的含量變化，驗證轉(zhuǎn)染效率。和miR-NC 相比，miR-mimic組miR-103含量大幅增加(P<0.05)，而anti-miR細胞miR-103含量顯著下降(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內(nèi)miR-103含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05)(圖 1)。

圖 1 q-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞內(nèi)miR-103的含量 圖 2 CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力

2.2 miR-103抑制DPSCs的增殖

驗證轉(zhuǎn)染效率后，利用CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力如圖 2，和miR-NC 相比，miR-mimic組DPSCs的增殖能力減弱(P<0.05)，而anti-miR組DPSCs的增殖能力增強(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組DPSCs的增殖能力未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

2.3 miR-103降低Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量

利用q-PCR技術(shù)檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化如圖 3，和miR-NC 相比，miR-mimic組Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量減少(P<0.05)，而anti-miR細胞Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內(nèi)Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

圖 3 q-PCR技術(shù)檢測各組細胞中Runx2, Osx和ALP等分化指標的mRNA含量變化

2.4 miR-103降低Runx2和Osx蛋白的表達

利用Western blot技術(shù)檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達如圖 4，和miR-NC 相比，miR-mimic組Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達減少(P<0.05)，而anti-miR細胞Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組細胞內(nèi)Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

圖 4 Western blot技術(shù)檢測各組細胞中Runx2和Osx等分化指標蛋白的表達

2.5 miR-103抑制DPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成

利用茜素紅染色的方法檢測各組細胞的礦化能力如圖 5，和miR-NC相比， miR-mimic組礦化能力減弱(P<0.05)，而anti-miR組礦化能力增強(P<0.05)；和Control相比，miR-NC組礦化能力未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。

圖 5 茜素紅檢測各組細胞的礦化能力

3 討 論

牙髓牙體疾病在口腔疾病中發(fā)病率較高，而就診的患者中有很大一部分的牙體牙髓已經(jīng)發(fā)生了不可逆的損傷，往往只能通過去除病變的牙體及牙髓的手段治療，達到癥狀緩解及恢復功能的目的[7]。而隨著組織工程技術(shù)的飛快發(fā)展，再生醫(yī)學在牙體牙髓研究領(lǐng)域也成為研究熱點。DPSCs是極具臨床應用潛力的間充質(zhì)干細胞，當牙髓組織受到損傷后DPSCs根據(jù)損傷情況，在精密的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下分化，修復損傷的牙髓組織或牙本質(zhì)[8]。而DPSCs增殖與分化等生物學行為的調(diào)控機制非常復雜，尚未完全闡明。

文獻綜述后發(fā)現(xiàn)miR-103在骨髓間充質(zhì)干細胞分化調(diào)控及成骨細胞增殖調(diào)控中具有重要作用[5，9]，為驗證miR-103對DPSCs增殖和分化的調(diào)控作用，研究利用細胞轉(zhuǎn)染核苷酸片段的技術(shù)體外成功過表達和降低表達miR-103。隨后發(fā)現(xiàn)過表達miR-103抑制DPSCs增殖，這與之前學者報道一致。Sun等[5]證實miR-103能夠通過作用于鈣離子通道關(guān)鍵蛋白Cav1.2抑制成骨細胞的增殖。Liao等[10]發(fā)現(xiàn)miR-103通過直接靶向周期相關(guān)蛋白CCNE1和CDK2抑制小鼠腸道細胞的增殖。還有學者證明miR-103在乳腺癌細胞中高表達，并在其增殖等生物學行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。

隨后還驗證了miR-103對DPSCs內(nèi)Runx2, Osx和ALP等分化指標表達的影響。Osx也是骨形成調(diào)控過程中不可缺少的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，缺少Osx會引起DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化障礙[6]。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化。為了進一步驗證miR-103抑制DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化，利用茜素紅染色檢測了miR-103對DPSCs礦化能力的影響，發(fā)現(xiàn)miR-103過表達抑制了DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化，并最終抑制了DPSCs的礦化作用。這和之前報道一致，Zuo等[9]發(fā)現(xiàn)miR-103能夠通過靶向作用Runx2在細胞水平和動物水平抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化和礦化能力。

綜上所述，miR-103能夠抑制DPSCs的增殖能力，并抑制DPSCs向成牙本質(zhì)細胞的分化。本實驗探討了miR-103對DPSCs增殖和分化的影響，但miR-103對DPSCs增殖和分化的調(diào)控機制仍有待進一步研究與探索。