響應(yīng)面優(yōu)化海洋放線菌DUT11 產(chǎn)衣霉素的發(fā)酵工藝*

徐小娜，牛海青，王曉霞，田 晴，高 茜

（咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000）

隨著人類對天然藥物的研究不斷加深，海洋微生物逐漸成為人們研究的重點，海洋獨特的環(huán)境造成了海洋放線菌的代謝途徑獨特復(fù)雜，從而使海洋放線菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣、結(jié)構(gòu)新穎且具有較強生物活性[1]，從而為天然活性藥物的開發(fā)提供一條重要途徑。其中，衣霉素就是一種海洋放線菌來源的抗生素。衣霉素具有抗酵母菌、白色念珠菌、葡萄桿菌、枯草芽孢桿菌等活性的核苷酸類抗生素[2-4]，可以開發(fā)為新型的抗真菌藥物及農(nóng)用殺蟲劑。文獻研究發(fā)現(xiàn)，衣霉素還具有明顯的抗補體活性，并已證實了衣霉素降低補體系統(tǒng)的活性是通過阻斷合成B、C2 和pro-C4 因子的糖基化，并抑制這些蛋白質(zhì)的分泌。然而，目前關(guān)于海洋放線菌發(fā)酵合成衣霉素的工藝研究鮮有文獻報道。因此，研究并開發(fā)基于海洋放線菌來源的衣霉素的發(fā)酵工藝，具有重要的理論意義及實際應(yīng)用價值。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，考察其抗補體活性代謝產(chǎn)物衣霉素的發(fā)酵工藝條件。研究通過單因素以及響應(yīng)面法優(yōu)化海洋放線菌株DUT11 的發(fā)酵工藝，進而提高衣霉素的產(chǎn)量，為衣霉素的研究開發(fā)提供一定的理論參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 菌株 海洋放線菌DUT11（采自大連星海灣海底沉積物），菌種保存在-80°C 冰箱里。

1.1.2 培養(yǎng)基 所用的培養(yǎng)基的配方見表1。

表1 培養(yǎng)基Tab.1 Media

1.1.3 主要儀器和試劑

SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺（蘇州凈化公司）；SX-300 型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Tomy 公司）；ZQZYBG 型搖床（上海知楚儀器有限公司）；DH5000B 型恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；FreeZone R型冷凍干燥機（LABCONCO）。

衣霉素標準品（純度≥98.0% 生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)與發(fā)酵條件

種子培養(yǎng) 將在甘油保存的菌種菌懸液涂布在5#固體培養(yǎng)基的平板上進行活化，28℃下培養(yǎng)4～8d后，刮取1cm2經(jīng)活化過菌株的孢子，接種于250mL三角瓶中，其中種子液裝有50mL，220r·min-1，28℃下培養(yǎng)3d 后得到種子液。

發(fā)酵過程 取4%的種子液接種于培養(yǎng)基中，于220r·min-1，28℃下培養(yǎng)6d。

1.2.2 樣品制備 取3mL 發(fā)酵液于10000r·min-1離心10min，得到菌絲體和上清液，菌絲體用甲醇超聲提取，收集菌絲體的甲醇提取物，將上清液和甲醇提取物合并后烘干，用1mL 甲醇超聲溶解，再通過0.22μm 濾膜過濾得到樣品，最后進行HPLC 分析。

1.2.3 衣霉素含量的測定 將衣霉素的標準品配制成1.0mg·mL-1的母液，倍半稀釋為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 和0.0156mg·mL-1等系列濃度，用HPLC（流動相水-乙腈；流速：0.6mL·min-1；C18制備柱：5μm，4.6×250mm，進樣量15μL，檢測波長260nm）通過面積歸一法測定標準曲線（圖1）。以峰面積為自變量，衣霉素濃度為因變量，得到衣霉素濃度C和峰面積的線性回歸曲線，來測定衣霉素的含量。

1.2.4 單因素試驗 采用單因素試驗依次對基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其配方、發(fā)酵時間等液體發(fā)酵工藝參數(shù)進行逐一優(yōu)化。每組試驗重復(fù)3 次，對其代謝產(chǎn)物進行HPLC 分析，找到能產(chǎn)生衣霉素含量最大的單因素發(fā)酵培養(yǎng)基及其配方的含量和發(fā)酵條件。

1.2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件 根據(jù)1.2.4 單因素試驗結(jié)果，以篩選出可溶性淀粉、黃豆粉和時間作為試驗因素，以衣霉素產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗設(shè)計Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken 設(shè)計三因素三水平的實驗，并利用響應(yīng)面法對菌株DUT11 最佳發(fā)酵工藝進行優(yōu)化（表2）。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of response surface methodology

1.3 模型的驗證試驗

將優(yōu)化后的最佳預(yù)測值進行發(fā)酵試驗，重復(fù)3次，取平均值。比較預(yù)測值和試驗所得到的實際值，進一步驗證響應(yīng)面法所得到的預(yù)測值，來確定響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵工藝是否準確可靠，是否具有實際的應(yīng)用價值。

2 結(jié)果與討論

2.1 繪制衣霉素的標準曲線

以峰面積為自變量，衣霉素濃度為因變量，得到衣霉素濃度C 和峰面積的線性回歸曲線，其方程為y=8×10-5x-0.0201，R2=0.999，方程式中x 為峰面積，y為衣霉素的濃度。衣霉素標準曲線見圖1。

圖1 衣霉素標準曲線Fig.1 Standard curve of tunicamycin

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選 取4%的同一批次種子液接種于7 種不同的培養(yǎng)基中（F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7），于28°C、220r·min-1條件下發(fā)酵6d，通過HPLC分析測定衣霉素的峰面積，計算衣霉素的產(chǎn)量。以衣霉素產(chǎn)量為指標，對菌株DUT11 的7 種液體培養(yǎng)基進行篩選，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株DUT11 不同培養(yǎng)基下衣霉素的產(chǎn)量Fig.2 Yield of tunicamycin under different culture medium of strain DUT11

由圖2 可知，F(xiàn)6培養(yǎng)基下衣霉素的產(chǎn)量最高，因此，選用F6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行發(fā)酵優(yōu)化。

2.2.2 可溶性淀粉的含量對菌株代謝產(chǎn)物中衣霉素產(chǎn)量的影響 將可溶性淀粉的含量調(diào)整為1%、2%、3%、4%、5%進行單因素實驗，通過HPLC 分析，測定衣霉素的峰面積，計算衣霉素的產(chǎn)量。結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，可溶性淀粉含量為3%時，衣霉素的產(chǎn)量達到最大，其衣霉素產(chǎn)量為50.2mg·L-1，再增加可溶性淀粉的含量，其菌株產(chǎn)衣霉素的含量反而下降。因此，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可溶性淀粉含量為3%時，生產(chǎn)衣霉素的量最多。

圖3 可溶性淀粉的含量對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of soluble starch content on the yield of tunicamycin

2.2.3 黃豆粉的含量對菌株代謝產(chǎn)物中衣霉素產(chǎn)量的影響 將黃豆粉的含量調(diào)整為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%進行單因素實驗，通過HPLC 分析，測定衣霉素的峰面積，計算衣霉素的產(chǎn)量。

由圖4 可知，黃豆粉含量為2%時，衣霉素的產(chǎn)量達到最大，衣霉素產(chǎn)量為51.1mg·L-1，再增加黃豆粉的含量，其菌株產(chǎn)衣霉素的含量反而下降。因此，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中黃豆粉含量為2%時生產(chǎn)衣霉素的量最多。

圖4 黃豆粉的含量對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of soybean powder concent on the yield of tunicamycin

2.2.4 酵母粉的含量對菌株代謝產(chǎn)物中衣霉素產(chǎn)量的影響 將酵母粉的含量調(diào)整為0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%進行單因素實驗，通過HPLC分析，測定衣霉素的峰面積，計算衣霉素的產(chǎn)量。

由圖5 可知，酵母粉含量為0.25%時，衣霉素的產(chǎn)量達到最大，衣霉素產(chǎn)量為42.9mg·L-1，再增加酵母粉的含量，其菌株產(chǎn)衣霉素的含量反而下降。因此，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中酵母粉含量為0.25%是生產(chǎn)衣霉素的最適宜濃度。

圖5 酵母粉的含量對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of yeast powder concent on the yield of tunicamycin

2.2.5 不同發(fā)酵時間對菌株代謝產(chǎn)物中衣霉素產(chǎn)量的影響 將發(fā)酵時間調(diào)整為3、4、5、6、7d 進行單因素實驗，通過HPLC 分析，測定衣霉素的峰面積，計算衣霉素的產(chǎn)量。結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵天數(shù)對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of fermentation days on the yield of tunicamycin

由圖6 可知，菌株DUT11 的代謝產(chǎn)物在不同的發(fā)酵時間，其衣霉素的產(chǎn)量表現(xiàn)出明顯的不同，發(fā)酵6d時衣霉素的產(chǎn)量達到最大，衣霉素產(chǎn)量為50.7mg·L-1，再增加發(fā)酵天數(shù)，其菌株產(chǎn)衣霉素的含量反而下降。因此，確定發(fā)酵6d 為最佳的發(fā)酵時間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗所得的結(jié)果，以可溶性淀粉的含量，黃豆粉的含量和發(fā)酵天數(shù)為自變量，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，對這17 組實驗進行研究，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果Tab.3 Results of response surface

2.3.2 模型建立與方差分析 根據(jù)表3 的試驗結(jié)果，通過Design-Expert 8.0.6 軟件處理數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到的方差分析見表4，得到的二次多項式回歸方程：Y=50.65+0.56A+4.45B+0.25C+0.072AB-0.66AC-0.94BC-1.47A2-1.36B2-5.67C2。

表4 回歸方程方差分析Tab.4 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表4 可知，P 值小于0.0001，說明該回歸方差模型是極顯著，決定系數(shù)R2值為0.9933，失逆項P值為0.0631 大于0.05 不顯著，說明模型的擬合度很好，由所選變量引起的響應(yīng)值為99.33%，表明實際值與預(yù)測值比較接近，可以采用此模型對衣霉素產(chǎn)量的發(fā)酵工藝參數(shù)進行預(yù)測。方差分析的結(jié)果顯示，B 和C2對衣霉素產(chǎn)量有極顯著的影響（P 值小于0.0001），A、BC、A2和B2均為顯著影響因素，C、AB和AC 影響均不顯著。由F 值推斷，3 個因素對衣霉素產(chǎn)量的影響大小依次為：黃豆粉的濃度（B）＞可溶性淀粉的濃度（A）＞發(fā)酵天數(shù)（C）。

2.3.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面是各試驗因子A、B 和C 值對響應(yīng)值Y 構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖能直觀地看出各因素與響應(yīng)值的交互作用。通過Design-Expert 8.0.6 軟件處理數(shù)據(jù)得到響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖7～9。

圖7 可溶性淀粉與黃豆粉的濃度對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect between soluble starch with soybean powder concentration on the yield of tunicamycin

圖7為可溶性淀粉的濃度（A）與黃豆粉的濃度（B）對衣霉素產(chǎn)量的影響。發(fā)酵天數(shù)為6d 時，由圖7（a）可知，隨著可溶性淀粉和黃豆粉濃度的增加，衣霉素產(chǎn)量提高無明顯變化；由圖7（b）可知，可溶性淀粉的濃度與黃豆粉濃度變化的交互作用不顯著。

圖8 為可溶性淀粉的濃度（A）與發(fā)酵天數(shù)（C）對衣霉素產(chǎn)量的影響。

圖8 可溶性淀粉濃度與發(fā)酵天數(shù)對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect between soluble starch concentration with fermentation days on the yield of tunicamycin

黃豆粉含量為2%時，由圖8（a）可知，隨可溶性淀粉和發(fā)酵天數(shù)的增加，衣霉素產(chǎn)量無明顯提高，即可溶性淀粉濃度與酵母粉濃度變化交互作用不顯著。

圖9 為黃豆粉的濃度（B）與發(fā)酵天數(shù)（C）對衣霉素產(chǎn)量的影響。可溶性淀粉的含量為3%時，由圖9（a）可知，黃豆粉對衣霉素產(chǎn)量的影響顯著，曲線比較陡；由圖9（b）可知，黃豆粉的濃度與發(fā)酵天數(shù)變化的交互作用較為顯著。

圖9 黃豆粉的濃度與發(fā)酵天數(shù)對衣霉素產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect between soybean powder concentration with fermentation days on the yield of tunicamycin

2.4 驗證試驗與結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面軟件分析預(yù)測到最佳的工藝條件為：可溶性淀粉的含量（A）、黃豆粉的含量（B）和發(fā)酵天數(shù)（C）分別為4%、2.5%和5.88d，理論上可產(chǎn)生衣霉素的量為52.98mg·L-1，根據(jù)實際情況，將最佳工藝條件調(diào)整為：可溶性淀粉的含量為4%、黃豆粉的含量為2.5%，發(fā)酵天數(shù)為6d，為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準確性，按上述工藝條件進行實驗，重復(fù)3 次，衣霉素的產(chǎn)量的平均值為53.15mg·L-1，其實驗結(jié)果與預(yù)測值相近，說明此模型合適可靠。

3 結(jié)論

對海洋放線菌DUT11 產(chǎn)衣霉素的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，首先，通過單因素試驗對海洋放線菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、發(fā)酵時間進行篩選并優(yōu)化，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F6，發(fā)酵時間為6d。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Design Expert Design-Expert 8.0.6 軟件，采用Box-Behnken 設(shè)計對衣霉素產(chǎn)量的工藝進行優(yōu)化。通過3次實驗驗證，在初始pH 值為7.0、可溶性淀粉4%，黃豆粉2.5%，酵母粉0.25%，KH2PO40.25%，CaCO30.3%，于220r·min-1，28℃下培養(yǎng)6d，在此條件下衣霉素的產(chǎn)量為53.15mg·L-1。實驗結(jié)果可為衣霉素以后的發(fā)展應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。