Box-Behnken 響應面法優(yōu)化柴胡多糖的超聲提取工藝*

陳雁雁，趙雅蘭，張淑香，張洪財，王文姌

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

柴胡（Bupleuri Radix）為臨床常用中藥材，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣，緩解抑郁的功能[1]。其分離出的柴胡多糖不僅無毒副作用，而且還有一系列的藥理作用[2]。近幾年研究表明，柴胡多糖會通過中斷HMGB1-TLR4 途徑而提供保護作用，從而抑制腎臟炎癥和纖維化過程[3]。Yuchen Feng 等通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)柴胡多糖可改善由鏈脲佐菌素誘導的糖尿病性腎病，其對小鼠糖尿病性腎病的作用與調節(jié)腸道菌群和炎癥有關[4]。這都表明，柴胡多糖有著巨大的開發(fā)價值和應用前景。

超聲提取法（Ultrasonication Extraction）是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速胞內有效物質的釋放、擴散和溶解，顯著提高提取效率的提取方法。相對于傳統(tǒng)提取方法，超聲提取法有操作方便、溶劑選擇性強、提取率高等優(yōu)點[5,6]；可將提取時間縮短2/3，并對熱不穩(wěn)定藥材成分與易水解易氧化的藥材成分有保護作用[7]。

本文采用超聲提取法對柴胡多糖的得率與含量進行了研究，以確定柴胡多糖的最佳提取工藝，為后續(xù)柴胡多糖的進一步研究提供了參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

柴胡（黑龍江中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院生藥學教研室鑒定為正品）。

苯酚（AR 天津奧普升化工有限公司）；無水葡萄糖對照品（成都樂美天醫(yī)科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

島津UV-1800 型紫外-可見分光光度計（島津企業(yè)管理有限公司）；DK-98-1 型超級恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-300E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；R2003KB型旋轉蒸發(fā)儀（SENCO Technology Co., Ltd.）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；AL204 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DZF-6020MBE 型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；DC-200 型高速多功能粉碎機（浙江武義鼎藏日用金屬制品廠）。

1.3 糖含量標準曲線的建立

采用“苯酚-濃硫酸法”進行測定[8]。

葡萄糖標準溶液的配制 取葡萄糖對照品適量，加蒸餾水制成0.2mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。分別精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 放置于10mL 容量瓶中，分別加水補至2mL，搖勻。

檢測波長的選擇 在2mL 的葡萄糖梯度溶液中各加5%苯酚試液1.0mL，搖勻，均勻滴加濃H2SO47.0mL，搖勻，靜置10min，再置沸水浴中加熱15min，取出，冷卻至室溫，在200～800nm 掃描。結果得到在488nm 波長處有最大吸收，故選擇488nm 為檢測波長。

標準曲線的制備 以對照品濃度C（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，得到回歸方程：Y=53.65X+0.0203，r2=0.9983。試驗結果表明，濃度在0.00～0.02mg·mL-1的范圍內曲線線性良好。

樣品的測定 精密稱取超聲提取的干燥恒重柴胡多糖20mg，置100mL 容量瓶中加水溶解定容，按照檢測波長下的操作配制樣品溶液，于488nm 處測定其吸光度。

1.4 換算因子的測定[9,10]

按照1.3 項下樣品溶液配制方法配制溶液，測定吸光度后計算其濃度。

式中 W：多糖質量，mg；D：多糖的稀釋因子；C：多糖溶液中葡萄糖濃度，mg·mL-1。

結果得出，超聲提取多糖對葡萄糖的換算因子為5.71。

1.5 柴胡多糖測定與計算

式中 C：樣品葡萄糖濃度，mg·mL-1；D：樣品溶液稀釋倍數(shù)；f：換算因子；W：供試品重量，mg。

1.6 超聲提取柴胡多糖工藝路線

準確稱取柴胡多糖2.0g，以1∶20 的料液比加入蒸餾水，超聲時間為20min，超聲2 次，合并濾液，用雙層紗布過濾。減壓濃縮濾液至20mL，加乙醇至醇濃度為75%，放置24h，抽濾，待試劑揮干后置干燥箱中干燥至恒重，所得粉末即為柴胡粗多糖。

1.7 單因素實驗

（1）超聲提取次數(shù)的影響 超聲次數(shù)設定為1、2、3、4 次，其他條件不變，平行試驗兩次。

（2） 超聲提取時間的影響 超聲時間設定為10、15、20、25、30min，其他條件不變，平行試驗兩次。

（3）超聲料液比的影響 料液比設定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），其他條件不變，平行試驗兩次。

1.8 Box-Behnken 響應面法超聲工藝優(yōu)化

采用Box-Behnken 響應面法對柴胡多糖的超聲提取工藝進行優(yōu)化。以單因素考察的實驗結果為依據(jù)，選擇超聲時間（A）、超聲次數(shù)（B）、料液比（C）為因素，綜合評分（Y）為響應值，采用Design-Expert 12 軟件設計3 因素3 水平響應面試驗。因素水平見表1。其綜合評分的計算公式為：

表1 響應面分析因子與水平Tab.1 Response surface analysis factor and horizontal table

綜合評分（%）=（多糖得率/得率最高值）×30%+（多糖含量/含量最高值）×70%

2 結果與討論

2.1 單因素考察結果

2.1.1 超聲提取次數(shù)的優(yōu)化結果

超聲提取次數(shù)優(yōu)化結果見圖1。

圖1 超聲提取次數(shù)對柴胡多糖得率和含量的影響Fig.1 Effect of ultrasound extraction times on the yield and content of Bupleurum polysaccharide

由圖1 可知，隨著超聲次數(shù)的增加，多糖得率一直增加；在提取第3 次時多糖含量略微下降，故選擇超聲次數(shù)為2 次比較合適。

2.1.2 超聲提取時間的優(yōu)化結果

超聲提取時間優(yōu)化結果見圖2。

圖2 超聲提取時間對柴胡多糖得率和含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on the yield and content of Bupleurum polysaccharide

由圖2 可知，隨著超聲時間的增加，多糖含量與多糖得率也在增加，在25min 時，柴胡多糖的得率與含量都達到最高點，25min 后兩者都略微減小，可能是因為超聲波剪切作用時間過長，破壞了多糖結構，故選20～30min 進行優(yōu)化。

2.1.3 料液比的優(yōu)化結果

超聲提取料液比優(yōu)化結果見圖3。

圖3 超聲料液比對柴胡多糖得率和含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic solid-liquid ratio on yield and content of Bupleurum polysaccharide

由圖3 可知，料液比在10～20（mL∶g）時，多糖得率和含量隨著料液比的增大而增大，當料液比超過20（mL∶g）時，多糖得率和含量都不同程度的減少，可知料液比為1∶20 比較合適，并選擇15～25mL·g-1進一步優(yōu)化。

2.2 響應面法優(yōu)化結果

2.2.1 Box-Benhnken 試驗結果

表2 響應面試驗結果Tab.2 Test results of respome swrface

2.2.2 方差分析和二元回歸方程擬合

使用Design-Expert 軟件對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸方程擬合。

由表3 可知，實驗模型F 值為34.70，P 小于0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項F=0.016，P 大于0.05，說明該模型擬合程度較好，能準確描述實驗結果，可用此模型對柴胡多糖含量進行分析和預測。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression model

本實驗分析得到的柴胡多糖含量的二次多元回歸方程：Y=95.57+1.64A+5.49B+11.59C-0.2949AB+0.2384AC+0.2515BC-6.22A2-4.63B2-10.86C2

2.2.3 交互作用分析

超聲次數(shù)和料液比對柴胡多糖提取量的響應面分析見圖4。

由圖4 可知，超聲次數(shù)和料液比的響應曲面均向下彎曲，超聲次數(shù)對柴胡多糖的提取影響更大。根據(jù)圖4 中可確定兩因素最佳水平參數(shù)為：超聲次數(shù)2 次左右，料液比在1∶19～1∶21（g∶mL）之間。

圖4 超聲次數(shù)、料液比交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of interaction between ultrasonic times and solid-liquid ratio

圖5為超聲次數(shù)、超聲時間交互作用的響應面圖和高等線圖。

由圖5 可知，超聲次數(shù)與超聲時間響應曲面均向下彎曲，超聲次數(shù)對柴胡多糖提取影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)為：超聲次數(shù)2 次左右，超聲時間在24～26min 之間。

圖5 超聲次數(shù)、超聲時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map ofinteraction between ultrasonic times and time

圖6為料液比、超聲時間交互作用的響應面圖和等高線圖。

圖6 料液比、超聲時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of interaction between solid-liquid ratio and time

由圖6 可知，等高線呈圓形，兩者的交互作用相當。確定兩因素最佳水平參數(shù)為：料液比在1∶19～1∶21（g∶mL）之間，超聲時間在24～26min 之間。

根據(jù)Design-Expert 12 統(tǒng)計軟件，以綜合評分Y 值最大值為指標，分析得到最佳提取工藝為：超聲時間26min，料液比1∶21（g∶mL），超聲次數(shù)為2 次，綜合評分99.47%。

2.3 驗證試驗

精密稱取柴胡藥材10g，以在最優(yōu)工藝的條件下平行操作3 次，計算柴胡多糖得率與含量的平均值，結果得到多糖得率11.31%，多糖含量67.13%，綜合評分98.82%。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取葡萄糖標準品溶液于488nm測定6 次，得到RSD 為0.15%。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取各提取方法下同一批次的供試品溶液，在對應的測定波長下，分別于0、30、60、90、120、150min 測定，得到RSD 為1.01%。

2.4.3 重復性試驗 相同條件下制備的6 份柴胡多糖供試液，在對應的測定波長下測吸光度A，計算RSD 為1.14%。

2.4.4 加樣回收實驗 精密稱取各提取方法下已知含量的同一柴胡供試品6 份，分別加入一定量標準品，按照樣品制備和含量測定方法項下操作，測定回收率。結果見表4。

表4 葡萄糖標準品加樣回收試驗Tab.4 Recovery test of glucose standard sample

3 結論

多糖是生命活動中必需的大分子之一[11]，具有多種生物活性[12]，可發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等作用[13-15]。多糖極性大，易溶于水[16]，若選用高溫提取、酸性或堿性提取，會使糖苷鍵斷裂，破壞多糖結構，故可采用超聲結合水提醇沉法來提取，成本較低，操作方便。

本文通過單因素考察和BBD 實驗研究了超聲時間、料液比、超聲次數(shù)3 個因素對柴胡多糖提取的影響，既提高了柴胡多糖的得率，又避免了柴胡多糖含量的損失。經優(yōu)化后得到柴胡多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：超聲時間26min，料液比1∶21（g∶mL），超聲次數(shù)為2 次。在最佳提取工藝條件下的多糖得率為11.31%，多糖含量為67.13%，綜合評分為98.28%，與預期值99.47%相近，說明該工藝優(yōu)化結果合理可行，為下一步柴胡多糖的抗抑郁研究奠定了基礎。