基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合差異分析及分子對接探討?zhàn)B陰清肺湯干預(yù)慢性阻塞性肺疾病的作用機(jī)制

袁梓珂，蔡孟成，金永生

0 引 言

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease，COPD)是一種以氣流阻塞為主要特征的慢性支氣管炎和(或)肺氣腫，嚴(yán)重者可發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示：我國40歲以上人群COPD的患病率高達(dá)9.4%[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及支氣管擴(kuò)張藥進(jìn)行干預(yù)。因此，研究COPD具有重要意義。目前，雖然可以改善患者的臨床癥狀但都存在著一些副作用。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在干預(yù)COPD方面具有不良作用小，起效平穩(wěn)等特點(diǎn)，越來越受到重視。養(yǎng)陰清肺湯出自《重樓玉鑰》，由生地、麥冬、甘草、玄參、貝母、丹皮、薄荷、白芍八味藥物組成，具有養(yǎng)陰潤燥，清肺利咽的功效，主治患者干咳少痰。臨床研究表明養(yǎng)陰清肺湯單獨(dú)干預(yù)或聯(lián)合常規(guī)治療干預(yù)COPD均可改善患者肺功能，緩解臨床癥狀，并且安全性較好[4-6]，但目前研究尚未明確養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合差異分析及分子對接技術(shù)探討?zhàn)B陰清肺湯干預(yù)COPD可能的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為臨床推廣提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)陰清肺湯潛在活性成分及靶點(diǎn)的獲取利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)根據(jù)cut-off>48，P<0.05獲取養(yǎng)陰清肺湯的活性成分和作用靶點(diǎn)。

1.2疾病靶點(diǎn)的獲取以"chronic obstructive pulmoriary disease"為關(guān)鍵詞，利用GeneCard數(shù)據(jù)庫(http://www.genecard.org/)獲取COPD的靶點(diǎn)。

1.3成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建利用R軟件維恩圖將1.1中的潛在活性成分靶點(diǎn)與1.2中的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得交集靶點(diǎn)。利用Perl程序prepareCyto.pl獲得潛在活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件，將該文件導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4GEO芯片差異基因獲取利用GEO數(shù)據(jù)庫檢索“chronic obstructive pulmoriary disease(COPD)”，物種選擇人類，選擇基因數(shù)據(jù)，下載基因矩陣與平臺數(shù)據(jù)文件，利用R軟件繪制火山圖。將1.3中獲得的潛在活性成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)的交集基因與GEO數(shù)據(jù)庫獲得的差異基因(P<0.05及-1

1.5GO與KEGG富集分析將1.4中的公共靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用ClueGO進(jìn)行GO和KEGG富集分析，其中GO分析主要分析生物過程(BP)和分子功能(MF)兩個(gè)部分。BP、MF的Evidence選擇All，物種選擇人類，GO與KEGG的P<0.05，其余保持默認(rèn)設(shè)置。

1.6分子對接利用1.3中度值較高的潛在活性成分與1.4中的公共靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，配體來源于Pubchem數(shù)據(jù)庫，受體來源于PDB數(shù)據(jù)庫，利用Pymol軟件去掉受體的配體，利用Autodock軟件對配體和受體進(jìn)行去水、加氫、加電荷操作，保存為pdbqt格式，利用Autogrid和Autodock將配體和受體進(jìn)行對接，利用Pymol軟件將結(jié)果可視化。

2 結(jié) 果

2.1 養(yǎng)陰清肺湯潛在成分獲取與靶點(diǎn)預(yù)測利用BATMAN數(shù)據(jù)庫根據(jù)cut-off>48獲得養(yǎng)陰清肺湯潛在活性成分95個(gè)，靶點(diǎn)498個(gè)?；钚猿煞种饕ǎ篖-天門冬酰胺(L-Asparagine)、薄荷酮(Piperitone)、3-甲基-6,7,8-三氫吡咯[1,2-A]嘧啶-2-酮(3-Methyl-6,7,8-Trihydropyrrolo[1,2-A]Pyrimidin-2-One)、延胡索乙素(Tetrahydropalmatine)、丙酮醛(Methylglyoxal)、腺苷(Adenosine)、胸腺嘧啶(Thymine)、那維定(Narwedine)、α-三羥基糞甾烷酸(Alpha-Trihydroxy Coprostanic Acid)和γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid)等，作用靶點(diǎn)主要包括：多巴胺受體D2(dopamine receptor D2,DRD2)、大麻素受體1(cannabinoid receptor 1,CNR1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶2(sterol O-acyltransferase 2，SOAT2)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin |glycosylated hemoglobin,HDA1C)、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)、孕酮受體(progesterone receptor,PGR)、KQT樣亞家族成員1(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1，KCNQ1)等。

2.2疾病靶點(diǎn)獲取從GeneCard數(shù)據(jù)庫中獲得COPD的靶點(diǎn)6577個(gè)。

2.3成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將潛在活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，藍(lán)色代表疾病靶點(diǎn)，紅色代表藥物靶點(diǎn)，交集獲得公共靶點(diǎn)237個(gè)，見圖1。利用Cytoscape構(gòu)建的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中紅色菱形代表潛在活性成分，紫色圓形代表靶點(diǎn)，連線代表潛在活性成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系。圖2中有化合物89個(gè)，靶點(diǎn)237個(gè)，邊516條。度值前9名的化合物與作用靶點(diǎn)見2.1主要活性成分與主要作用靶點(diǎn)。

圖1 潛在活性成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)交集維恩圖

圖2 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4GEO芯片差異基因獲取利用GEO數(shù)據(jù)庫檢索GSE148877芯片數(shù)據(jù)，篩選得到107個(gè)樣本，其中觀察組樣本79個(gè)，對照組樣本28個(gè)，獲得P<0.05及-1

2.5GO與KEGG富集分析GO富集分析結(jié)果顯示養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的生物過程包括：谷胱甘肽衍生物代謝過程、氧化還原酶活性。分子功能包括：谷胱甘肽過氧化物酶活性、乙醇脫氫酶活性，鋅依賴性、類固醇δ異構(gòu)酶活性。KEGG富集分析結(jié)果表明養(yǎng)陰清肺干預(yù)COPD的作用機(jī)制包括：谷胱甘肽代謝、糖異生/糖酵解和藥物代謝。見圖4。

a：生物過程;b:分子功能;c:通路富集分析

2.6分子對接利用Pubchem下載度值較高的活性成分薄荷酮的3D結(jié)構(gòu)，利用PDB數(shù)據(jù)庫分別下載ADH1C、GSTT1以及GSTA1的蛋白結(jié)構(gòu)(PDB號分別為：1HT0、2C3T、3I69)，分子對接結(jié)果顯示薄荷酮與ADH1C、GSTT1以及GSTA1的結(jié)合能分別為-3.83、-3.54和-2.61 kcal/mol，一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低發(fā)生作用的可能性越大[7]。說明薄荷酮與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合能力，分子對接模式圖見圖5。

a：薄荷酮-ADH1C分子對接模式圖;b：薄荷酮-GSTT1分子對接模式圖;c：薄荷酮-GSTA1分子對接模式圖

3 討 論

煙塵吸入是COPD的危險(xiǎn)因素，中醫(yī)認(rèn)為煙塵吸入損耗肺陰、傷及肺液，致使陰虛肺燥，當(dāng)養(yǎng)陰清肺。養(yǎng)陰清肺湯是治療陰虛肺燥的代表方，臨床研究表明：養(yǎng)陰清肺湯可以改善COPD患者臨床癥狀與肺功能指標(biāo)[8]。并且Meta結(jié)果表明，養(yǎng)陰清肺湯聯(lián)合常規(guī)治療能提高臨床療效[5]。從中醫(yī)角度上，養(yǎng)陰清肺湯方中生地、玄參、麥冬養(yǎng)陰潤燥，清肺解毒，為君藥；白芍助君藥增強(qiáng)養(yǎng)陰之功，丹皮清熱涼血增強(qiáng)清肺之能，為臣藥；貝母清痰利心肺，薄荷開肺利咽喉，共治咳嗽，為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，瀉火解毒，為使藥，這些形成了中醫(yī)干預(yù)COPD的機(jī)制?，F(xiàn)代研究表明養(yǎng)陰清肺湯具有調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)的作用[9-10]，這些與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過抗炎、改善微循環(huán)、緩解平滑肌痙攣、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能改善COPD患者臨床癥狀的治療原則相一致[11]。但是，其潛在的活性成分與作用靶點(diǎn)有待探究。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合差異分析發(fā)現(xiàn)：養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的潛在活性成分包括薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等潛在靶點(diǎn)，包括ADH1C、GSTT1與GSTA1。這體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

現(xiàn)代研究表明薄荷酮具有抗炎、利膽、促滲等作用[12]。延胡索乙素通過抑制肺纖維化，抑制炎癥因子、減少氧化損害的作用[13]。腺苷衍生化合物對COPD小鼠氣道炎癥有明顯抑制作用[14]。綜上，這些潛在活性成分可能通過協(xié)同作用共同干預(yù)COPD。薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等物質(zhì)可能通過抗氧化或抗炎等機(jī)制來干預(yù)COPD。體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分干預(yù)疾病的特點(diǎn)。

本研究差異分析結(jié)果顯示：ADH1C、GSTT1、GSTA1是養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的關(guān)鍵基因。研究表明，COPD患者如果長期大量接觸乙醇會(huì)損害黏液纖毛，從而惡化患者的肺功能，最終提高患者的死亡率。ADH1C對酒精介導(dǎo)的氣道功能改變機(jī)制可在一定程度上干預(yù)COPD，維持患者肺功能不進(jìn)一步惡化[15]。而GSTT1與COPD的發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)，有研究表明GSTM1/GSTT1組合缺失基因型可能會(huì)顯著增加中國人群COPD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[16-18]。并且有研究推測GSTA1在患者氣道中的過表達(dá)對氣道壁細(xì)胞具有保護(hù)作用[19]。所以養(yǎng)陰清肺湯通過作用于ADH1C、GSTT1、GSTA1等靶點(diǎn)對COPD患者進(jìn)行一定的干預(yù)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥干預(yù)疾病多靶點(diǎn)多機(jī)制的特點(diǎn)和優(yōu)勢。

GO和KEGG富集分析表明：養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的機(jī)制主要通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝來進(jìn)行，而谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化物[20]；此外，養(yǎng)陰清肺湯還能通過調(diào)控氧化還原酶活性對氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。養(yǎng)陰清肺湯通過這些氧化機(jī)制的調(diào)控來對COPD進(jìn)行干預(yù)。分子對接結(jié)果表明養(yǎng)陰清肺湯的主要化學(xué)成分薄荷酮對于3個(gè)關(guān)鍵基因ADH1C、GSTT1、GSTA1均有一定的結(jié)合能力，也為養(yǎng)陰清肺湯通過關(guān)鍵靶點(diǎn)干預(yù)COPD提供了依據(jù)。

綜上所述，養(yǎng)陰清肺湯干預(yù)COPD的潛在活性成分可能是薄荷酮、延胡索乙素、腺苷等物質(zhì)，這些成分可能通過抗氧化和抗炎等機(jī)制來干預(yù)COPD。而薄荷酮可以通過作用于ADH1C、GSTT1、GSTA1靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝及氧化應(yīng)激通路發(fā)揮干預(yù)COPD的作用。但本研究仍存在一定的局限性，如潛在活性成分在體內(nèi)的代謝情況、潛在活性成分在中藥中的含量未進(jìn)行深入探究。但本研究結(jié)果可以為日后COPD的臨床藥物的研發(fā)和相關(guān)通路的探索提供一定的理論依據(jù)。