miR-430對(duì)斑馬魚原始生殖細(xì)胞遷移和性腺發(fā)育影響的初步研究?

林小涵， 金超凡， 高 晨， 汪 波??， 賀 艷，2， 齊 潔，2， 張全啟，2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

生殖細(xì)胞是多細(xì)胞生物體內(nèi)能繁殖后代的細(xì)胞的總稱，包括PGCs及其分化后形成的生殖細(xì)胞。PGCs通過有絲分裂產(chǎn)生，隨后遷移至原始性腺形成的區(qū)域，也就是生殖嵴，通過進(jìn)一步的分化形成精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞，最終分化生成成熟的卵子和精子。

miRNA是內(nèi)源性的非編碼小RNA，含有18～25個(gè)核苷酸，以序列特異性的方式參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，通過識(shí)別和招募蛋白復(fù)合物結(jié)合到靶基因的 3′UTR來抑制翻譯或影響mRNA穩(wěn)定性，在細(xì)胞增殖、分化以及器官發(fā)育等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。其保守的種子區(qū)由5′端的第2～7位核苷酸組成，是靶向配對(duì)過程中的決定因子[2]。單個(gè)miRNA可以結(jié)合多個(gè)靶mRNA，因此每個(gè)miRNA均可以參與并調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程[3]。

miRNAs在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色，主要參與PGCs的分化、生殖細(xì)胞的維持及發(fā)育過程，這在之前的研究中已經(jīng)得到了廣泛的證明。在果蠅PGCs遷移分化過程中，miR-6和miR-9能夠影響vasa和nanos的表達(dá)，這些基因都是關(guān)鍵的生殖質(zhì)組分[4]。在生殖細(xì)胞的維持及分化過程中，miRNA同樣發(fā)揮著十分重要的功能。例如在生殖干細(xì)胞自我更新時(shí)，miRNA在有絲分裂的G1期向S期轉(zhuǎn)換的過程中，通過抑制細(xì)胞周期抑制因子dap來促進(jìn)生殖干細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)生殖干細(xì)胞的自我更新[5]。此外，果蠅中的miR-184可以調(diào)控sax受體表達(dá)，進(jìn)而影響雌性生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化過程[6]。在小鼠中，miR-122a主要在晚期雄性生殖細(xì)胞中表達(dá)，抑制精子發(fā)生過程中特異性表達(dá)的mRNA。

盡管miRNAs的功能得到了廣泛的證實(shí)，但是在魚類中的研究還較少，大部分都在斑馬魚和青鳉等模式生物中進(jìn)行[7-9]。miR-430家族最初是在硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，該家族在脊椎動(dòng)物中高度保守，與其他脊椎動(dòng)物miRNAs在進(jìn)化上密切相關(guān)。在斑馬魚中，miR-430家族在受精卵中合子基因轉(zhuǎn)錄開始時(shí)表達(dá)，是合子基因組中最早轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平最高的基因簇之一[10]，能直接調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)靶基因。其中，大多數(shù)靶基因是母源基因，在缺失miR-430的情況下會(huì)在細(xì)胞中積累[11]。在斑馬魚胚胎發(fā)育的過程中，miR-430參與維持PGCs特異性表達(dá)基因的調(diào)控。例如，miR-430可靶向體細(xì)胞中的nanos和tdrd7基因，降低它們mRNA的穩(wěn)定性并且抑制其翻譯，從而維持它們?cè)赑GCs生殖質(zhì)中的特異性表達(dá)和分布[8]。此外，miR-430還影響趨化因子sdf1a和cxcr7b的表達(dá)，通過降解原表達(dá)域內(nèi)的sdf1amRNA來調(diào)節(jié)其表達(dá)量和分布范圍，同時(shí)調(diào)節(jié)cxcr7b的表達(dá)水平以避免sdf1a過度消耗，確保PGCs的準(zhǔn)確遷移[12]。但是斑馬魚PGCs遷移到生殖嵴之后，在其向成熟的生殖細(xì)胞分化以及性腺發(fā)育的過程中，miR-430的功能還未得到探究。

本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過上調(diào)miR-430的表達(dá)探究其對(duì)斑馬魚PGCs的形成、遷移、生殖細(xì)胞發(fā)育以及性腺發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-430會(huì)導(dǎo)致斑馬魚PGCs遷移紊亂，并且造成nanos3等生殖細(xì)胞標(biāo)記基因mRNA表達(dá)量的顯著下調(diào)。通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-430會(huì)造成卵母細(xì)胞發(fā)育異常，卵巢發(fā)育遲緩，但不影響斑馬魚的性別分化以及精巢的發(fā)育。

1 材料方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚包括野生型AB品系以及CZ18品系，均購(gòu)買于國(guó)家斑馬魚資源中心。其中CZ18品系為kop：EGFP-UTR-nanos3轉(zhuǎn)基因斑馬魚，其PGCs可特異性表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)。成魚飼養(yǎng)在自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中，水溫控制在28 ℃，光周期為14 h光照/10 h黑暗，喂食鹵蟲或魚飼料(每天3～4次)。斑馬魚受精卵放置于斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中，在28 ℃恒溫條件下孵育，孵化后在靜水中飼養(yǎng)一個(gè)月，而后轉(zhuǎn)移至水循環(huán)系統(tǒng)中喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射和熒光檢測(cè) miR-430 mimic (5′-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3′)和Control miRNA (5′-UAACACGUCUAUACGCCCA-3′)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；LNA-430 (5′-ACAGGCCGGGACAAUGCAAUA-3′)由EXIQON公司合成，其與miR-430有較高的結(jié)合親和力，用于抑制miR-430的功能。在斑馬魚胚胎1細(xì)胞時(shí)期進(jìn)行顯微注射，其中miR-430 mimic和LNA-430的注射濃度均為5 μmol/L。

使用尼康SMZ1500體視顯微鏡在胚胎不同發(fā)育階段觀察和跟蹤PGCs的形成以及定位。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在受精后12 h收集30枚AB品系斑馬魚胚胎，每個(gè)處理重復(fù)取樣3次，用PBS清洗后轉(zhuǎn)移至RNA wait中，4 ℃保存。按照說明書用TRIzol法提取斑馬魚胚胎RNA，使用g-eraser反轉(zhuǎn)試劑盒(寶生物工程有限公司)合成cDNA。

用Primer5設(shè)計(jì)定量引物，選擇β-actin作為內(nèi)參基因，本研究所用引物詳見表1。使用寶生物工程有限公司的2xSYBR Green PCR Master Mix試劑和羅氏Lightcycler 480 PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的拷貝數(shù)，用SPSS 2.0進(jìn)行顯著性分析。

表1 本研究所用引物

1.2.3 報(bào)告載體構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取nanos3的基因序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增nanos3的3′UTR區(qū)域，將其克隆至pMD-19T載體，驗(yàn)證序列正確性后，用XhoⅠ和HindⅢ酶對(duì)nanos33′UTR和EGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化后測(cè)序獲得EGFP-nanos33′UTR報(bào)告載體。用XhoⅠ酶線性化報(bào)告載體后，按照Message Machine SP6試劑盒(賽默飛公司)的指示在體外合成mRNA。

1.2.4組織切片 為檢測(cè)過表達(dá)miR-430對(duì)斑馬魚性腺發(fā)育的影響，分別在30、60和100時(shí)取斑馬魚性腺樣品，每個(gè)處理組隨機(jī)取30尾斑馬魚樣品。放在4%多聚甲醛中過夜保存，隨后梯度甲醇脫水，-20 ℃保存。將樣品切成2～3 mm3的小塊，經(jīng)脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋，使用徠卡RM2016切片機(jī)切片，分別在60和37 ℃條件下展片和烘片，在脫蠟、脫水后進(jìn)行切片染色和封片。使用尼康A(chǔ)Z100熒光顯微鏡觀察不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚性腺切片結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-430影響PGCs遷移

為檢驗(yàn)合成的miR-430能否影響PGCs的形成及遷移，本文作者將miR-430 mimic注射到CZ18品系斑馬魚的1細(xì)胞時(shí)期的胚胎中，使用熒光顯微鏡檢測(cè)PGCs的形成和遷移情況。檢測(cè)結(jié)果表明miR-430不影響PGCs的正常形成，但在原腸晚期發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-430的胚胎中PGCs的遷移發(fā)生紊亂，多數(shù)PGCs分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遷移運(yùn)動(dòng)(見圖1a’)，而對(duì)照組胚胎中的PGCs以體軸為中心聚集成兩簇進(jìn)行遷移(見圖1e’)。在胚胎發(fā)育至受精后20 h時(shí)，miR-430過表達(dá)的胚胎中PGCs的排列更為分散，排成一列向生殖嵴遷移(見圖1b’)。在受精后24 h時(shí)，對(duì)照組中PGCs簇已經(jīng)遷移至生殖嵴附近(見圖1g’)，而過表達(dá)miR-430的胚胎中部分PGCs遷移至卵黃延伸部的尾端，定位在生殖嵴以外的區(qū)域(見圖1c’)。受精后36 h時(shí)PGCs遷移已經(jīng)結(jié)束，對(duì)照組中PGCs聚集在生殖嵴區(qū)域(見圖1h’)，相較于對(duì)照PGCs的緊密分布，過表達(dá)組胚胎中PGCs排列松散，并且部分PGCs定位在卵黃延伸部的尾端(見圖1d’)。本文作者還對(duì)PGCs的遷移情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(見圖1B)，結(jié)果表明過表達(dá)組中有86%的胚胎出現(xiàn)PGCs遷移紊亂的表型，顯著高于對(duì)照組。

(A. 注射miR-430 mimic和Control miRNA的胚胎中PGCs的遷移情況。a～d分別為受精后9、20、24和36 h miR-430 mimic注射組胚胎(白光)；a’～d’分別為受精后9、20、24和36 h miR-430 mimic注射組胚胎(熒光)；e～h分別為受精后9、20、24和36 h對(duì)照組胚胎(白光)；e’～h’分別為受精后9、20、24和36 h對(duì)照組胚胎(熒光)。箭頭指示遷移中的PGCs。B. 注射miR-430 mimic和Control miRNA后表型統(tǒng)計(jì)，每組處理分別統(tǒng)計(jì)了200枚胚胎。數(shù)據(jù)代表平均值±誤差； 表示p < 0.01。A. PGCs migration in embryos injected with Control miRNA and miR-430 mimic. a～d: Embryos from miR-430 mimic injected group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (white light); a’～d’: Embryos from miR-430 mimic injected group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (fluorescent light); e～h: Embryos from control group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (white light); e’～h’: Embryos from control group at 9, 20, 24 and 36 h post fertilization (fluorescent light). Arrows indicate PGCs in migration. B. Phenotype statistics after injection of Control miRNA and miR-430 mimic, 200 embryos were examined for each group. The data represent the mean ±SD (error bars); indicates p<0.01.)

隨后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了過表達(dá)miR-430對(duì)生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因nanos3、piwil2和tdrd7的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，在PGCs遷移的關(guān)鍵時(shí)期，miR-430的過表達(dá)會(huì)引起內(nèi)源nanos3、piwil2和tdrd7mRNA表達(dá)水平的顯著下調(diào)。在確定miR-430影響靶基因的表達(dá)后，通過將LNA-430、miR-430 mimic和Control miRNA分別與體外合成的EGFP-nanos33′UTR混合后共注射斑馬魚受精卵，進(jìn)一步探究了過表達(dá)和抑制miR-430的表達(dá)對(duì)其靶基因nanos3表達(dá)和分布的影響。在受精后36 h時(shí)，熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照中綠色熒光蛋白可以在生殖細(xì)胞中表達(dá)，并且生殖細(xì)胞簇定位在生殖嵴(見圖3C、C’)。在注射LNA-430的處理組中(見圖3A、A’)，觀察到斑馬魚全身熒光相對(duì)于對(duì)照組增強(qiáng)，并且無(wú)法準(zhǔn)確辨認(rèn)被標(biāo)記的PGCs。在共同注射EGFP-nanos33′UTR和miR-430 mimic組中(見圖3B、B’)，斑馬魚體內(nèi)的綠色熒光明顯弱于以上兩個(gè)處理組，并且發(fā)現(xiàn)PGCs遷移紊亂，部分PGCs定位于生殖嵴以外的區(qū)域。

(數(shù)據(jù)代表平均值±SD(誤差棒)；表示p<0.01。The data represent the mean ±SD (error bars); indicates p<0.01.)

(A和A’代表共注射LNA-430和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚；B和B’代表共注射miR-430 mimic和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚；C和C’代表共注射Control miRNA和EGFP-nanos3 3′UTR的斑馬魚。箭頭指示PGCs的定位。A and A’ represent zebrafish injected with LNA-430 and EGFP-nanos3 3’UTR; B and B’ represent zebrafish injected with miR-430 mimic and EGFP-nanos3 3’UTR; C and C’ represent zebrafish injected with Control miRNA and EGFP-nanos3 3’UTR. Arrows demonstrate the location of PGCs.)

2.2 miR-430對(duì)性腺發(fā)育和性別分化的影響

為了進(jìn)一步探究miR-430對(duì)斑馬魚性腺發(fā)育的影響，向AB品系斑馬魚受精卵中注射miR-430 mimic，制備受精后第30、60和100天的性腺組織切片并進(jìn)行觀察分析(見圖4A、B)。受精后第30天的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組切片結(jié)果表明，斑馬魚性腺發(fā)育正常，此時(shí)性腺未出現(xiàn)明顯的雄魚特征，均表現(xiàn)為雌性特征。卵母細(xì)胞處于初級(jí)生長(zhǎng)期，卵母細(xì)胞發(fā)育正常，和對(duì)照相比沒有明顯區(qū)別。對(duì)2月齡斑馬魚性腺組織切片的觀察發(fā)現(xiàn)，在注射miR-430的斑馬魚中，雄魚性腺和對(duì)照組并無(wú)區(qū)別；對(duì)照組的卵母細(xì)胞處于從初級(jí)生長(zhǎng)期向卵黃發(fā)生期過渡的階段，而過表達(dá)組的卵巢發(fā)育明顯滯后，卵母細(xì)胞數(shù)目少且發(fā)育異常，細(xì)胞形態(tài)不完整。在受精后第100 天時(shí)，斑馬魚已經(jīng)性成熟，精巢中有大量精細(xì)胞形成，同時(shí)可以觀察到精原細(xì)胞和精母細(xì)胞；此時(shí)卵母細(xì)胞進(jìn)入成熟期，卵黃顆粒基本充滿卵母細(xì)胞，而過表達(dá)miR-430組的卵母細(xì)胞發(fā)育略有滯后，其內(nèi)部的卵黃顆粒數(shù)目明顯少于對(duì)照組卵黃顆粒數(shù)目。

(A. 受精后第30、60和100天對(duì)照組和miR-430 mimic注射組斑馬魚的卵巢切片；B. 受精后第60和100天對(duì)照組和miR-430 mimic注射組斑馬魚的精巢切片。PO為初級(jí)生長(zhǎng)期卵母細(xì)胞，PVO為卵黃發(fā)生前卵母細(xì)胞，VO為卵黃發(fā)生期卵母細(xì)胞，MO為成熟卵母細(xì)胞，SG為精原細(xì)胞，SP為精母細(xì)胞，SD為精細(xì)胞。標(biāo)尺均為20 μm。A. Ovarial histology examination of zebrafish from control group and miR-430 mimic injected group at 30, 60, and 100 d post fertilization; B. Spermatic histology examination of zebrafish from control group and miR-430 mimic group at 60, and 100 d post fertilization. PO, primary-growth oocyte; PVO, previtellogenic oocyte; VO, vitellogenic oocyte; MO, mature oocyte; SG, spermatogonia; SP, spermatocyte; SD, spermatid. Scale bar=20 μm.)

另外，在受精后第100 天時(shí)對(duì)斑馬魚性腺的大小進(jìn)行了進(jìn)一步分析測(cè)定，解剖觀察結(jié)果如圖5所示，注射miR-430組雄魚的精巢和對(duì)照組雄魚的精巢形態(tài)與大小不存在明顯差異；而注射miR-430的雌魚的卵巢明顯發(fā)育不良、體積偏小，約為對(duì)照組卵巢體積的二分之一。

圖5 受精后100 d的斑馬魚性腺

在出生后第100天，已經(jīng)可以通過表觀特征群區(qū)分斑馬魚的雌雄，雄魚的胸鰭表面存在鋸齒狀突起(見圖6A)，雌魚的胸鰭表面光滑(見圖6B)。在顯微鏡下觀察斑馬魚胸鰭鑒定雌雄比例，發(fā)現(xiàn)miR-430注射組雄魚胸鰭表面鋸齒狀突起較少(見圖6C)且沒有對(duì)照組明顯。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：miR-430注射組23.5%雄魚，76.5%雌魚；對(duì)照組24.0%雄魚，76.0%雌魚，表明斑馬魚的性別分化不受miR-430的影響。

(A和B分別代表對(duì)照組雄性和雌性斑馬魚胸鰭；C和D分別代表miR-430過表達(dá)組雄性和雌性斑馬魚胸鰭。A and B: Pectoral fins of male and female zebrafish in the control group; C and D: Pectoral fins of male and female zebrafish in the miR-430 overexpression group.)

3 討論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)miR-430的過表達(dá)會(huì)引起斑馬魚PGCs遷移的紊亂，致使部分PGCs無(wú)法正常遷移至生殖嵴，并且導(dǎo)致nanos3等PGCs特異性表達(dá)基因mRNA水平降低。在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，上調(diào)miR-430可以抑制卵母細(xì)胞的發(fā)育，并且造成卵巢發(fā)育遲緩，但是對(duì)斑馬魚精巢發(fā)育及性別分化沒有明顯影響。

miR-430此前已被證明在PGCs遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miR-430及其哺乳動(dòng)物同源基因miR-302均可拯救miRNAs缺失突變體中的PGCs異位表型，miR-430能夠通過調(diào)節(jié)趨化因子sdf1a和cxcr7bmRNA的表達(dá)確保PGCs的準(zhǔn)確遷移[12]。本研究通過注射miR-430 mimic在斑馬魚胚胎中過表達(dá)miR-430，同樣發(fā)現(xiàn)PGCs的定位出現(xiàn)異常，從另一個(gè)角度探究了miR-430對(duì)PGCs遷移的影響。在斑馬魚中，PGCs的形成由生殖質(zhì)這種特殊的母源性細(xì)胞質(zhì)決定[13]，一些母源mRNA，如dnd、vasa和nanos3等定位于生殖質(zhì)中，這些mRNA隨著胚胎發(fā)育被整合進(jìn)入體細(xì)胞和PGCs。miR-430在受精卵中合子基因轉(zhuǎn)錄開始時(shí)就大量表達(dá)[7]，由于受到miR-430介導(dǎo)的mRNA去烯化、mRNA降解和翻譯抑制，部分生殖質(zhì)基因在體細(xì)胞中會(huì)被迅速降解。在PGCs中，其靶mRNA也受到miR-430的調(diào)控[11]，但nanos3和tdrd7mRNA 3′UTR中的順式作用元件能補(bǔ)償miR-430介導(dǎo)的抑制作用，使這些mRNA能在PGCs中穩(wěn)定存在。此外，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，一些生殖系特異性RNA結(jié)合蛋白也在維持生殖質(zhì)基因的特殊表達(dá)模式中發(fā)揮重要作用。其中，dnd1可以通過結(jié)合mRNA以及阻止miRNAs與靶位點(diǎn)的相互作用，來抵消斑馬魚PGCs中miR-430等miRNAs的功能[14]；DAZL能與tdrd7結(jié)合，通過誘導(dǎo)poly (A)尾部的伸長(zhǎng)(聚腺苷酸化)來緩解miR-430介導(dǎo)的對(duì)tdrd7mRNA的抑制[15]。這些機(jī)制共同作用，保證了nanos3和tdrd7等基因在PGCs中的穩(wěn)定表達(dá)和功能發(fā)揮。在本研究中，miR-430的過表達(dá)會(huì)進(jìn)一步加劇其對(duì)體細(xì)胞中靶mRNA的抑制作用，并且超出了PGCs中nanos3和tdrd7等基因的順式作用元件以及DAZL和dnd等保護(hù)機(jī)制對(duì)miR-430介導(dǎo)的降解的補(bǔ)償范圍，進(jìn)而導(dǎo)致這些生殖質(zhì)基因在PGCs中表達(dá)量減少。

斑馬魚中已有的研究顯示nanos3的正常表達(dá)對(duì)于PGCs的遷移和存活至關(guān)重要，敲降nanos3會(huì)造成部分PGCs的錯(cuò)誤定位[16]。本研究結(jié)果證明過表達(dá)miR-430可導(dǎo)致內(nèi)源nanos3表達(dá)的下調(diào)以及外源nanos33′UTR的分布和定位變化，和已有的研究結(jié)果是一致的。表明miR-430可以通過調(diào)控PGCs中nanos3等生殖質(zhì)基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)PGCs的遷移運(yùn)動(dòng)。

魚類的卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟受下丘腦、垂體和卵巢產(chǎn)生的激素控制[17]，卵母細(xì)胞的成熟是在卵泡刺激素(LH)、成熟誘導(dǎo)激素(MIH)和成熟促進(jìn)因子(MPF)三種主要調(diào)節(jié)因子的控制下發(fā)生的[18]。近些年來，多項(xiàng)研究證明有多種miRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在硬骨魚類的卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟以及卵子發(fā)生等過程中發(fā)揮作用。青鳉miR-202在卵子發(fā)生/卵泡發(fā)生中的起到關(guān)鍵作用，敲除miR-202導(dǎo)致早期卵泡發(fā)育受損，卵子數(shù)量減少[19]。斑馬魚23號(hào)染色體上的miRNA-200簇是卵母細(xì)胞成熟和排卵所必需的[20]。已有研究在斑馬魚卵泡細(xì)胞中檢測(cè)到了miR-430b，認(rèn)為miR-430b可能參與調(diào)控斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟[21]。

斑馬魚的性腺發(fā)育一般從出生后第30天開始，在性別分化之前，所有性腺均發(fā)育為卵巢；在出生后第40～50天期間，性腺開始分化；當(dāng)發(fā)育到第60天時(shí)，性腺分化結(jié)束，卵巢和精巢形成。已有的研究表明，足夠數(shù)量的早期生殖細(xì)胞對(duì)雌性斑馬魚的性發(fā)育至關(guān)重要，斑馬魚早期胚胎中生殖細(xì)胞的缺失，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育為雄性[22]。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)miR-430會(huì)影響斑馬魚卵母細(xì)胞的正常發(fā)育，并導(dǎo)致卵巢發(fā)育遲緩，但不影響斑馬魚的性別分化。由于PGCs在遷移到生殖嵴后能與體細(xì)胞共同形成原始性腺，并最終增殖分化形成兩性配子，PGCs的正常遷移和準(zhǔn)確定位是其功能發(fā)揮的前提條件。因此，本文作者推測(cè)過表達(dá)miR-430導(dǎo)致部分PGCs不能正常遷移至生殖嵴，造成定位于生殖嵴的PGCs數(shù)目減少，進(jìn)而影響了后續(xù)卵巢的正常發(fā)育。

綜上所述，本研究對(duì)miR-430在斑馬魚生殖細(xì)胞發(fā)育中的功能進(jìn)行了初步探究。證明過表達(dá)miR-430會(huì)造成PGCs遷移紊亂，miR-430可能通過影響PGCs中nanos3、piwil2和tdrd7等生殖質(zhì)基因的表達(dá)及定位，在PGCs遷移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另外，在胚胎發(fā)育早期上調(diào)miR-430還會(huì)將會(huì)影響性腺分化時(shí)期卵母細(xì)胞的正常發(fā)育，導(dǎo)致卵巢發(fā)育遲緩。上述結(jié)果為后續(xù)研究miR-430在PGCs遷移和生殖細(xì)胞發(fā)育中的分子調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。