一例華南虎淋巴瘤的診斷與分析

陳騰騰 傅文源，2 林錫潘 張 樂 蘭作閩，4 童 鑫 林煒明 林藝群，6 林開雄*

(1.福建梅花山華南虎繁育研究所，上杭，364201；2.龍巖市地質(zhì)公園保護(hù)發(fā)展中心，龍巖，364000；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；4.龍巖市野生動(dòng)植物保護(hù)管理站，龍巖，364000；5.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖，364012；6.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌，330045)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)又名中國(guó)虎，僅分布于中國(guó)，是最古老的虎亞種，國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物[1]。自2001年以來，已沒有可靠證據(jù)表明野外存在華南虎繁殖群體[2]。就現(xiàn)階段而言，圈養(yǎng)在各動(dòng)物園、繁育基地的約200只華南虎[3]，將是復(fù)壯種群的唯一希望。疾病作為困擾種群發(fā)展的重要因素，往往是造成動(dòng)物死亡的直接原因[4-5]，淋巴瘤就是其中之一。淋巴瘤又稱淋巴癌，一種原發(fā)于淋巴結(jié)和淋巴組織的惡性腫瘤，是一種慢性消耗性疾病。瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴血液途徑擴(kuò)散，形成大小不等的結(jié)節(jié)或致密腫塊，可影響淋巴結(jié)及周圍臟器。根據(jù)血象變化，淋巴瘤可分為“白血病性淋巴瘤”和“非白血病性淋巴瘤”兩大類[6]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，外源性因素和內(nèi)源性因素是誘發(fā)淋巴瘤的致病原因[7]。在貓科(Felidae)動(dòng)物腫瘤疾病中，淋巴瘤的發(fā)生較常見，約占貓科動(dòng)物惡性腫瘤疾病的33%，并與貓科動(dòng)物的白血病發(fā)生呈高度相關(guān)[8]。本研究將分析1例華南虎的淋巴瘤病例，針對(duì)該虎的發(fā)病實(shí)況和死后病理剖檢情況進(jìn)行探討，旨在為華南虎的淋巴瘤診斷提供參考。

1 基本概況

患虎為成年雌性華南虎，來自福建梅花山華南虎繁育研究所，16歲，體型較瘦。其食物以雞肉塊、新鮮牛肉和新鮮野豬肉為主。參與首次繁殖前，有不定期的嘔吐史，嘔吐物為黏液及未消化的肉塊。2016年開始繁殖后，基本無嘔吐現(xiàn)象，2018年4月最后一次參與繁殖時(shí)，出現(xiàn)食幼崽情況。發(fā)病前采食量正常(4.0～5.5 kg/d)，與人親近。

2 臨床癥狀

2019年1月22日，華南虎日采食量下降，當(dāng)日采食量?jī)H為正常采食量的一半，但精神好，主動(dòng)與人親近，被毛光亮順滑。自2月5日起，偶有進(jìn)食，呈漸進(jìn)性消瘦。鑒于此，在飼養(yǎng)管理上，飼養(yǎng)員調(diào)整了其食物結(jié)構(gòu)，在投喂雞骨架、小牛肉的基礎(chǔ)上，增加新鮮牛肉和新鮮野豬肉。同時(shí)，將該虎放至散放區(qū)幾日，增加其活動(dòng)范圍。之后1周內(nèi)，該虎食欲差，甚至廢絕，精神狀態(tài)沉郁，舌苔蒼白，基本不排便，尿液呈黃色。2月26—27日，出現(xiàn)雙眼無神、喜臥、后肢輕微抖動(dòng)等神經(jīng)癥狀。獸醫(yī)于2月28日對(duì)該虎進(jìn)行麻醉取樣，同時(shí)將其抬至保定籠中進(jìn)行注射、輸液治療，在輸液過程中該虎死亡。

3 常規(guī)檢查及救治

對(duì)華南虎進(jìn)行麻醉保定檢查，發(fā)現(xiàn)其體表淋巴結(jié)顯著腫大，口腔齒齦、鞏膜等可視黏膜存在黃染。整個(gè)病情發(fā)展較為迅速?；诹餍胁W(xué)考慮，研究人員懷疑該虎存在血液原蟲病感染，遂在其食物中添加血蟲凈藥物進(jìn)行驅(qū)蟲，此時(shí)患虎偶有進(jìn)食，精神尚佳。2周后，患虎呈漸進(jìn)性消瘦，精神變差，舌苔蒼白，尿液顏色加深，基本不排便，以飲水中添加抗生素進(jìn)行保守治療。隨后的病程中，患虎呈現(xiàn)雙眼無神、喜臥、后肢輕微抖動(dòng)等癥狀。以4.0 mL陸眠靈、2.0 mL鹽酸氯胺酮、1.0 mL硫酸阿托品及0.5 mL鹽酸腎上腺素進(jìn)行麻前給藥與麻醉，并配合抗血液原蟲治療及補(bǔ)液支持療法，行肌注5%三氮脒10.0 mL(1.0 g三氮脒溶于20.0 mL體積分?jǐn)?shù) 0.9%的生理鹽水)，10%右旋糖酐鐵注射液(以Fe計(jì)50.0 mL：5.0 g)4.0 mL，尾靜脈滴注250.0 mL葡萄糖氯化鈉溶液及30.0 mL維生素C。整個(gè)病程持續(xù)1個(gè)多月，患虎于2019年2月底死亡。

4 剖檢工作

4.1 體表檢查

觸摸虎體尚有余溫，觀察口腔、鼻孔、耳孔、肛周等天然孔腔無污染，體表無脫毛現(xiàn)象，無外傷痕跡，無體表寄生蟲?？捎^察到眼睛、口腔可視黏膜及舌苔黃染(圖1)。

圖1 華南虎初步檢查

4.2 皮下及腹腔檢查

皮下脂肪、胸腹腔壁出現(xiàn)嚴(yán)重黃染(圖2A、B)。胸腹腔中各臟器體位正常，膈膜完整，腹腔內(nèi)有黃色積液，于四肢關(guān)節(jié)窩處發(fā)現(xiàn)黃色積液。

觀察胸腹腔臟器，可見：①肝腫大，質(zhì)脆。肝臟表面及實(shí)質(zhì)內(nèi)布滿灰白色結(jié)節(jié)，其大小相近，觸摸堅(jiān)硬有顆粒感(圖2C)。②脾腫大、質(zhì)脆，切開可見布滿大小不一的灰白色結(jié)節(jié)，一側(cè)表面分布有白色點(diǎn)狀突起，該突起大小相近，觸摸較軟(圖2D)。③肺萎縮，表面散布灰白色結(jié)節(jié)，大小較為一致，質(zhì)硬，部分肺葉表面散布黑點(diǎn)，肺葉邊緣組織膨大呈空泡狀(圖2E)。④腎實(shí)質(zhì)表面散布灰白色結(jié)節(jié)，觸摸堅(jiān)硬有顆粒感，其中腎盂有黃染(圖2F)。⑤胰腺腫大，表面布滿灰白色結(jié)節(jié)，其大小相近，觸摸堅(jiān)硬有顆粒感(圖2G)。⑥膽囊外觀正常，膽汁呈正常墨綠色。⑦膀胱黃染，無尿，膀胱內(nèi)壁一側(cè)散布有白色突起物，觸摸軟。⑧胃外觀黃染，胃剖開無異常。⑨胸腔內(nèi)心臟結(jié)構(gòu)完整，心肌、心外膜無出血。

觀察淋巴結(jié)，可見：在淺表淋巴結(jié)中(圖2H)，雙側(cè)下頜9個(gè)淋巴結(jié)腫大似雞蛋。兩側(cè)鎖骨上7個(gè)淋巴結(jié)腫大如鴨蛋。兩側(cè)腋下10個(gè)淋巴結(jié)腫大壞死，大如鴨蛋。腹股溝淋巴結(jié)腫大。在深部淋巴結(jié)中，頸淋巴結(jié)腫大，腫大程度大小不一，并有部分壞死。腸系膜淋巴結(jié)腫大，形狀不規(guī)則并有部分壞死。

圖2 華南虎剖檢結(jié)果

5 實(shí)驗(yàn)室診斷

5.1 固定液的配置

配置終濃度為2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液，簡(jiǎn)稱雙醛固定液[9]。具體配方如下：取10 g多聚甲醛溶于100 mL去離子水中，加熱至65 ℃，期間逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，緩慢搖動(dòng)，待溶液澄清透明，冷卻待用。PB溶液配置，A液，取7.8 g NaH2PO4·2H2O溶于去離子水中，定容至250 mL；B液，取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于去離子水中，定容至1 000 mL。取234.5 mL A液與1 000.0 mL B液混合均勻，即為PB溶液。取上述配置的多聚甲醛溶液100 mL，加入到250 mL的PB溶液中，再添加50 mL的25%戊二醛溶液，去離子水定容至500 mL，棕色瓶中保存，備用。采用雙醛混合液的方式，可以更好地使醛分子滲入組織，加快蛋白變性凝固，以防止細(xì)胞死后發(fā)生自溶或被細(xì)胞分解，從而保持組織細(xì)胞原本的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

5.2 切片制作

切取各新鮮組織的病料塊(厚度不宜超過1 cm)放入雙醛固定液中，充分浸泡后，置于冰箱冷藏室(2～6 ℃)，24 h后即可制作切片。根據(jù)大量預(yù)試驗(yàn)摸索出組織塊梯度脫水和浸蠟的最優(yōu)時(shí)間(表1)。浸蠟后的組織塊置于包埋機(jī)中進(jìn)行包埋蠟塊過程。切片時(shí)，切取5 μm薄片進(jìn)行脫蠟、染色，染色時(shí)間需嚴(yán)格控制(表1)，以防背景顏色對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生干擾。染色后的切片以中性樹脂封片。

表1 組織塊的脫水、浸蠟和切片染色時(shí)間

5.3 光鏡下觀察

使用光學(xué)顯微鏡觀察制作好的切片，結(jié)果顯示：各組織切片中均可明顯看到瘤細(xì)胞已經(jīng)嚴(yán)重侵蝕內(nèi)臟器官，并散布在這些內(nèi)臟器官結(jié)構(gòu)中。瘤細(xì)胞呈彌漫性排列，浸潤(rùn)并慢慢擠壓周邊的正常組織細(xì)胞。瘤細(xì)胞形態(tài)大小較為一致，呈圓形或卵圓形，體積小胞質(zhì)少核大圓，染色呈深色。

肝臟(圖3A)：肝實(shí)質(zhì)被大量淋巴細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞取代，形成包膜明顯的腫瘤細(xì)胞區(qū)，肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索的結(jié)構(gòu)紊亂。

脾臟(圖3B)：局部多處散在脾臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞被淋巴細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞取代，脾小梁萎縮，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，白髓紅髓間無明顯界限。

肺臟(圖3C)：支氣管黏膜層縱行皺襞逐漸消失，淋巴瘤侵入管腔，透明軟骨細(xì)胞大量壞死。肺小葉局部存在結(jié)締組織增生，肺泡隔細(xì)胞成分增多，出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞，肺泡隔增厚，并伴隨淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

腎臟(圖3D)：腎實(shí)質(zhì)被淋巴細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞取代，腫瘤區(qū)腎小管等結(jié)構(gòu)全部消失，零星存在的腎小球被淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。其余未被腫瘤細(xì)胞取代的腎實(shí)質(zhì)處，發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞壞死、核溶解、消失，局部可見形成的管形；腎小球結(jié)構(gòu)紊亂、萎縮，甚至消失。

胰腺(圖3E)：實(shí)質(zhì)細(xì)胞被淋巴細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞取代。

淋巴結(jié)(圖3F)：被許多濾泡樣結(jié)構(gòu)占據(jù)，這些結(jié)構(gòu)由中型至大型淋巴細(xì)胞組成。這些細(xì)胞包漿稀少，細(xì)胞核圓形，染色體呈細(xì)點(diǎn)狀，常見明顯的核仁。偶見有絲分裂相。

圖3 華南虎組織病理變化

6 結(jié)果

剖檢結(jié)果顯示，患虎全身淋巴結(jié)均腫大壞死，肝、脾、腎、胰、肺等臟器表面均有灰白色結(jié)節(jié)。肝損傷導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的黃疸，致使全身明顯黃染。腎臟異常，使得患虎在排尿及尿液顏色方面出現(xiàn)問題，加之飲水少使得尿色出現(xiàn)濃茶色樣。肺臟萎縮，邊緣組織膨大如空泡狀，致使機(jī)體氣體交換氧合作用降低。各臟器組織功能的損傷，引起機(jī)體運(yùn)轉(zhuǎn)異常，使患虎出現(xiàn)精神不振、不愿運(yùn)動(dòng)、喜臥等癥狀。僅從剖檢結(jié)果看，患虎是因機(jī)體大部分器官受到不同程度的損壞，打破機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡，最終致死。

組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，患虎各臟器都有不同程度的損壞。從切片鏡檢中均可發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞樣瘤細(xì)胞浸潤(rùn)于各臟器組織內(nèi)。在淋巴結(jié)中，正常淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)被大片形態(tài)一致的淋巴細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞取代，且多個(gè)器官被累及。通過觀察，研究人員還發(fā)現(xiàn)臟器中的腫瘤細(xì)胞與淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞形態(tài)一致。瘤細(xì)胞主要以分裂細(xì)胞為主，呈淋巴樣細(xì)胞，其細(xì)胞組織形態(tài)符合細(xì)胞性惡性淋巴瘤。根據(jù)剖檢記錄和病理組織切片的觀察，最終判定為體表、腸系膜淋巴結(jié)B細(xì)胞惡性淋巴瘤，累及肝脾、肺、腎臟、胰腺等組織。由于這些器官組織的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，嚴(yán)重影響著機(jī)體的正常運(yùn)作和健康，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡。

7 討論

腫瘤是虎(Pantheratigris)的多發(fā)性疾病[10]。據(jù)報(bào)道，動(dòng)物園中圈養(yǎng)虎的腫瘤發(fā)病率高達(dá)33%，患腫瘤個(gè)體占死亡個(gè)體的69%[11]。此外，張向鵬[12]調(diào)查并統(tǒng)計(jì)了貴州地區(qū)3種野生動(dòng)物的常見疾病，結(jié)果顯示華南虎的疾病發(fā)生率占總體發(fā)病率的44%。

虎為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，屬大型猛獸，治療中不像臨床體型較小的動(dòng)物易控制、好接觸，在疾病診斷方面尤為困難。短暫全麻診斷療法的麻醉風(fēng)險(xiǎn)要遠(yuǎn)高于腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。所以，一般情況下均采取保守治療，在食物或飲水中添加抗生素。本案例中，患虎出現(xiàn)食欲廢絕、精神差、喜臥而不愿運(yùn)動(dòng)時(shí)，考慮病情已危及生命，行全麻后扎留置針以靜脈輸液進(jìn)行治療。僅根據(jù)一般臨床癥狀，還不足以用來確診病因，但如果出現(xiàn)持續(xù)性食欲減弱、體型消瘦、淺表淋巴結(jié)腫大等，可考慮進(jìn)一步抽血化驗(yàn)，從而有針對(duì)性地、全面地制定診療方案。若在癌癥早期確診，還可考慮進(jìn)行藥物或手術(shù)切除以控制和緩解病情。

病理診斷是診斷腫瘤的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13]。本研究中，患虎發(fā)病可能由多方面原因所致。由于所內(nèi)未發(fā)現(xiàn)其他虎出現(xiàn)異常情況和臨床特征，基本排除了所內(nèi)存在傳染性疾病因素，懷疑發(fā)病原因與患虎本身機(jī)體情況、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及免疫缺陷等有關(guān)。患虎發(fā)病前有嘔吐史，可能已顯示機(jī)體免疫力低下。初步懷疑其消化道已有一定的疾病，淋巴瘤的發(fā)生與其嘔吐既往病史是否有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。