血細(xì)胞單采制備富血小板血漿治療難愈性創(chuàng)面的效果觀察

周鵬，溫子歡，羅琳，徐甜，劉欣雨

（1.江西省上饒市立醫(yī)院輸血科；2.江西省上饒市立醫(yī)院骨科，江西 上饒 334000）

難愈性創(chuàng)面是指不能通過正常愈合機(jī)制治愈的創(chuàng)面，患者往往伴有糖尿病、感染、壓瘡等[1]，不僅治療難度大，而且治療效果往往不理想。富血小板血漿(Platelet rich plasma，PRP)采集自身血液制備，作為自體生長(zhǎng)因子的來源，具有極強(qiáng)的修復(fù)作用[2]，并且安全可靠。目前PRP臨床廣泛應(yīng)用于骨科、整形美容外科、口腔科等學(xué)科。近年來，中外大量文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道PRP應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面取得良好的效果，但目前PRP的制備方法和治療方案均未統(tǒng)一，直接對(duì)最終治療效果有所影響。本文對(duì)血細(xì)胞分離單采制備PRP，運(yùn)用于難愈性創(chuàng)面治療所取得的良好效果，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年1月至2020年5月難愈性創(chuàng)面患者19例，其中男性13例，女性6例；年齡54～72歲，平均年齡61.4±5.5歲；其中糖尿病足13例、褥瘡1例、骨骼或肌腱組織外露3例、深層肌肉組織暴露1例、脈管炎引起下肢皮膚潰爛1例。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡及性別不限；（2）若患有其他疾病，需經(jīng)過正規(guī)治療后病情平穩(wěn)；（3）創(chuàng)面經(jīng)清創(chuàng)換藥、負(fù)壓封閉引流及靜滴抗生素治療至少4周以上且無好轉(zhuǎn)跡象或持續(xù)惡化；（4）沒有用過免疫抑制劑的患者；（5）取得患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）血紅蛋白＜100 g/L，血小板＜150×109/L；（2）有精神疾病以及無自知力，依從性差者；（3）孕婦、哺乳期的婦女；（4）伴有血液疾?。唬?）近期服用過抗凝劑，近期服用過免疫抑制劑。

1.2 儀器設(shè)備 血細(xì)胞分離機(jī)（COM.TEC，德國費(fèi)森尤斯公司）；血小板分離管路（C5L，德國費(fèi)森尤斯公司）；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（BC-6900，深圳邁瑞公司）；-80℃超低溫保存箱（DW-86L338J，青島海爾公司）；一次性無菌離心管(美國CORNING公司)。

1.3 治療方法

1.3.1 PRP制備 根據(jù)患者創(chuàng)面大小及其基礎(chǔ)血小板值，設(shè)置采集PRP修復(fù)的最佳濃度（1000-1500×109/L）[6]，采集量（100～150 mL）使用血細(xì)胞分離機(jī)及其專用管路采集PRP，采集過程中留取患者血漿50 mL備用。采集后充分混勻并檢測(cè)初始PRP濃度，如超過預(yù)期值，可用患者自身血漿進(jìn)行稀釋。在超凈工作臺(tái)中，使用無菌吸樣管分裝至無菌離心管中，每管10 mL，取一管立即使用，其余放置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。再次使用時(shí)，放置37℃水浴箱，震蕩復(fù)融并檢測(cè)其濃度。

1.3.2 PRP凝膠制備 取200 U凝血酶凍干粉，加入2 mL葡萄糖酸鈣注射液，作為激活劑，使用前與制備好的PRP1:10混合后，充分混勻，制備成PRP凝膠。

1.3.3 PRP治療 對(duì)患者創(chuàng)面進(jìn)行徹底清創(chuàng)，清除壞死組織和炎性肉芽組織，將制備好的PRP凝膠均勻覆蓋在創(chuàng)面上，使用無菌凡士林紗布固定住PRP凝膠，讓PRP中的生長(zhǎng)因子持續(xù)作用于創(chuàng)面上，再行包扎。每5d進(jìn)行一次PRP治療。

1.4 觀察指標(biāo) （1）PRP濃度監(jiān)測(cè)，觀察超低溫保存對(duì)其濃度是否有影響。（2）記錄PRP治療次數(shù)、創(chuàng)面體積及創(chuàng)面愈合情況，將創(chuàng)面愈合分為4級(jí)：痊愈：完全愈合，覆蓋率達(dá)到100%；顯效：患者創(chuàng)面明顯愈合，且覆蓋率達(dá)到75%～100%；有效：創(chuàng)面有效愈合，覆蓋率為25%～75%，無效：無愈合，覆蓋率低于25%。（3）細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)：分別對(duì)PRP治療前、后患者創(chuàng)面分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀察感染情況。（4）安全性：治療過程中，觀察并記錄患者是否存在創(chuàng)面擴(kuò)大、感染加重等不良反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用百分比表示。創(chuàng)面體積以及創(chuàng)面覆蓋率組間使用方差分析；對(duì)每次PRP濃度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)觀察是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRP濃度19例患者基礎(chǔ)血小板（231.16±82.11）×109/L，制備PRP中濃度為（1248.26±149.51）×109/L，平均提升5.4倍。分別在使用前測(cè)試各管PRP濃度，初始制備（1號(hào)）與超低溫存放（2-10號(hào)）不同時(shí)間的PRP濃度未見明顯差異，P＞0.05，見表1。

表1 各管間PRP濃度比較（±s；濃度單位：109/L）

表1 各管間PRP濃度比較（±s；濃度單位：109/L）

PRP濃度t 1 1249.43±139.21 2 1231.14±128.78 0.54 3 1280.29±119.24 0.93 4 1236.43±131.21-0.69 5 1205.71±120.35 1.03 6 1142.29±167.38 1.51 7 1273.71±142.33 1.08 8 1295.44±123.35 1.37 9 1305.24±158.10-0.6 10 1412.31±125.25-1.17

圖2 患者中年男性，糖尿病足，外傷引起左足大面積皮膚脫套傷，植皮術(shù)后足背皮膚壞死，創(chuàng)面45天難以愈合，行PRP治療8次后創(chuàng)面愈合。

2.2 PRP治療效果觀察 經(jīng)過4-10次PRP治療，平均7.29次，患者的創(chuàng)面減小，肉芽組織填充完好，創(chuàng)面體積和覆蓋率明顯改善，15例患者痊愈，4例患者顯效。見表2、圖1-2。

圖1 患者老年男性，糖尿病足并感染，行截肢清創(chuàng)植皮術(shù)后皮膚壞死，創(chuàng)面難以愈合1月余，行PRP治療8次后，創(chuàng)面愈合。

表2 19例患者治療前后創(chuàng)面體積與覆蓋率的比較（±s）

表2 19例患者治療前后創(chuàng)面體積與覆蓋率的比較（±s）

治療前 治療8次 治療10次 F P創(chuàng)面體積（mL）覆蓋率（%）治療2次6.16±2.27 47.41±23.14治療4次 治療6次4.72±2.31 56.46±22.44 10.84±3.22 1.23±1.16 88.65±13.40 3.28±2.08 70.54±19.27 0.92±1.43 91.51±10.31 13.28 11.46＜0.01＜0.01

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)情況 治療前創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)陽性的患者有16例（84.21%），治療后，創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)陽性者2例（21.05%），顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.69，P＜0.01）。見表3。

表3 19例患者治療前后創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的比較（n/%）

2.4 安全性 整個(gè)治療過程中，未出現(xiàn)患者創(chuàng)面擴(kuò)大、感染加重等不良反應(yīng)。患者對(duì)治療滿意度高。

3 討論

難愈性創(chuàng)面影響因素繁多，衰老、細(xì)菌感染、局部生長(zhǎng)因子的含量下降等因素均可抑制創(chuàng)面再生，致創(chuàng)面難以愈合[7-8]，給患者身心帶來巨大痛苦。

富血小板血漿（PRP）是人體血液通過密度離心得到的富含血小板的血漿成分，其中含有包括血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulinlike growth factor 1IGF-1)等大量生長(zhǎng)因子[9]。血小板通過凝血酶和鈣激活后可以脫顆粒釋放上述生長(zhǎng)因子[10]，達(dá)到修復(fù)的目的。有研究表明，PRP需要達(dá)到特定濃度，才能發(fā)揮最佳修復(fù)作用[6]。目前臨床使用PRP制備方法以PRP套裝和抗凝管二次離心法[4-5]為主，這兩種方法在面對(duì)大面積創(chuàng)面時(shí)，不但需要反復(fù)采集患者血液，而且得到PRP的體積也有限，增加患者痛苦和治療費(fèi)用。

本研究通過血細(xì)胞分離機(jī)制備PRP，根據(jù)患者基礎(chǔ)血小板值、患者PRP治療內(nèi)容、患者創(chuàng)面的大小等情況制定治療方案，只采集所需的血小板，其余血液均回輸，避免患者醫(yī)源性失血。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，此方法能安全有效的得到血小板制品，對(duì)患者的血細(xì)胞計(jì)數(shù)影響極小，在短時(shí)間內(nèi)血小板即可恢復(fù)到采集前水平。血細(xì)胞分離機(jī)單次采集即可保證PRP的體積和濃度，并通過分裝后的超低溫保存，達(dá)到多次、大面積治療的目的，這是手工制備PRP所無法比擬的。從結(jié)果中可以看出，PRP濃度和治療次數(shù)得到保證，創(chuàng)面體積及創(chuàng)面覆蓋率明顯改善，減少患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高患者的生活質(zhì)量，患者滿意度也隨之增高。

本研究中還觀察到，超低溫保存的PRP，其濃度未見明顯改變。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，血小板低溫保存狀態(tài)下，保存液添加與否對(duì)其濃度無顯著變化，未添加保存液會(huì)造成血小板激活內(nèi)容物質(zhì)釋放。PRP的修復(fù)原理正是需要激活血小板的相關(guān)因子，達(dá)到修復(fù)功能，所以我們?cè)赑RP的低溫保存過程中未添加任何保存液。超低溫保存血小板的推薦保存條件為-80℃，保存時(shí)間6個(gè)月，在此條件下血小板回收率可達(dá)到99%；解凍后的最佳使用時(shí)間為2 h內(nèi)[13]，本文按此方法處理PRP，使用效果理想。有學(xué)者[14]在動(dòng)物模型試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低溫保存PRP與新鮮PRP具有同樣修復(fù)作用，這為超低溫保存PRP提供了理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)不足之處，未對(duì)超低溫保存PRP的功能進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在今后工作中我們將持續(xù)觀察研究超低溫保存對(duì)PRP生長(zhǎng)因子的影響，為PRP超低溫保存的有效性提供更有力的證據(jù)。

研究表明PRP具備良好的抗菌功效[15]，本研究觀察到16例患者在治療前創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)陽性，經(jīng)過治療后僅有2例細(xì)菌培養(yǎng)陽性者，前后對(duì)比有顯著差異，也印證PRP的抗感染效果。國外有學(xué)者報(bào)道，PRP被激活后釋放多種抗菌肽[16]，有效輔助感染性創(chuàng)面的愈合。近年來，體外抑菌試驗(yàn)表明[17]，PRP凝膠（PLG）的抑菌作用最為明顯，4 h內(nèi)有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，為難愈性創(chuàng)面提供修復(fù)環(huán)境。

綜上所述，血細(xì)胞分離單采制備PRP在難愈性創(chuàng)面的應(yīng)用有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和療效，可以根據(jù)患者的實(shí)際情況擬定治療方案，并且保證質(zhì)和量，值得臨床推廣。