陰道脫落細胞中PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的相關(guān)性分析

豆中敏，李紫陽

（1.周口市第一人民醫(yī)院婦科，河南 周口 466700；2.周口市第一人民醫(yī)院普外科，河南 周口 466700）

宮頸癌是發(fā)生在宮頸部位的一種惡性腫瘤，多發(fā)生與中老年女性[1]。高危型人乳狀瘤病毒（HRHPV）持的主要原因[2]。從HR-HPV持續(xù)感染到癌前病變，再到宮頸癌的發(fā)生是一個較長的過程，定期篩查和注射疫苗有助于早期預(yù)防宮頸癌的發(fā)生[3]。因此早期診斷、盡早治療續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生有助于提高治療效果，改善預(yù)后[4]。陰道局部環(huán)境內(nèi)的免疫性細胞因子在宮頸病變發(fā)病機制中發(fā)揮的作用受到了越來越廣泛的重視[5]。程序性死亡分子1(PD-1)、程序性死亡配體1(PD-L1)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在機體的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)中起重要作用，有研究報道其在肝癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤疾病中有表達，并與腫瘤預(yù)后有關(guān)[6]。在以往的研究中關(guān)于PD-1、PD-L1、MIF水平與HR-HPV感染及宮頸癌病變程度均有報道，但關(guān)于三者聯(lián)合檢測的報道較少，本研究以不同宮頸病變患者為研究對象，檢測不同宮頸病變患者陰道分泌液中PD-1、PD-L1、MIF表達水平，探討陰道局部微環(huán)境中PD-1、PD-L1、MIF水平的變化與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關(guān)系，為臨床宮頸癌的早期診斷與預(yù)防提供新的思路與參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)收集2017年1月至2020年3月到本院婦科門診進行宮頸癌篩查結(jié)果中宮頸HR-HPV陽性的150例患者為研究對象，對其進行HPV分型檢測及宮頸液基細胞學(xué)檢查，根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果將150例患者分別記為慢性宮頸炎組47例，低級別上皮內(nèi)病變組43例，高級別上皮內(nèi)病變組31例，宮頸癌組29例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）受檢者有性生活史；（2）無免疫疾病者；（3）配合檢查；（4）受檢前3 d無陰道沖洗及放藥，24 h內(nèi)無性生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）妊娠期貨月經(jīng)期；（3）子宮切除史；（4）近期內(nèi)有服用抗生素及免疫抑制劑。

1.2 檢測方法 陰道分泌液中PD-1、PD-L1、MIF檢測方法及陽性標(biāo)準(zhǔn)：將門診完成取材的陰道分泌物送至門診實驗室進行陰道分泌物檢測，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測標(biāo)本中的PD-1、PD-L1、MIF水平，將檢測樣本進行石蠟包埋樣本切片處理，將切片放置在30%的乙醇中進行處理，放置在45～50℃水槽中進行展片，放入45℃的溫箱中進行干燥，之后在蒸餾水中浸泡1 min進行水化，在蘇木素水溶性溶液中進行染色，待HE染色玻片制備完成后，在顯微鏡下觀察宮頸癌癌細胞和浸潤淋巴細胞染色情況。檢測過程中使用的MIF鼠抗人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體to PD1、小鼠單克隆抗體IgG1抗體均購自美國abcam公司。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) PD-1、PD-L1、MIF以包膜和細胞質(zhì)呈棕黃色著色為陽性[7]。每個切片選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計數(shù)陽性細胞百分?jǐn)?shù)，同時觀察陽性細胞染色強度。以陽性細胞百分?jǐn)?shù)計數(shù)：≤5%為0分，6%～35%為1分，36%～65%為2分，≥65%為3分；以染色強度計分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分，將兩種計分的相加的總分進行判斷，評分＞2分為陽性，≤2分為陰性。

1.4 HR-HPV檢測 將取材好的標(biāo)本封裝固定，送至病理科實驗室，宮頸HPV采用Cobas 4800 HPV DNA檢測方法進行檢測，根據(jù)宮頸脫落細胞DNA及β-globin的Ct值判讀確定HR-HPV陽性結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo) （1）收集不同宮頸病變組患者的臨床資料，包括年齡、初次性生活年齡、分娩次數(shù)，比較資料的均衡性。（2）比較不同宮頸病變患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平。（3）比較不同宮頸病變患者HR-HPV感染情況。（4）比較HR-HPV感染與HR-HPV未感染患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平。（5）采用Spearman相關(guān)性分析PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，比較用χ2檢驗，采用Spearman相關(guān)性分析PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者的臨床資料比較 四組患者的年齡、初次性生活年齡、分娩次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組患者的臨床資料比較[（n）%]

2.2 各組患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平比較隨著宮頸組織病變的進展PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈增高趨勢，組間比較有差異(P＜0.05)，且PD-1、PD-L1、MIF在SCC組表達水平顯著高于其他三組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組患者的PD-1、PD-L1、MIF表達水平比較[(n)%]

2.3 不同級別的宮頸病變中HR-HPV感染情況比較 四組不同程度的宮頸病變HR-HPV陽性率分別為31.91%、65.12%、83.87%、100.00%，HR-HPV陽性率隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的加重而升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同級別的宮頸病變中HR-HPV感染情況比較[(n)%]

2.4 HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達比較HR-HPV(+)組的PD-1、PD-L1、MIF表達水平高于HR-HPV(-)組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達比較[(n)%]

2.5 相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析，HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關(guān)（P＜0.05），宮頸病變程度與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

表5 PD-1、PD-L1、MIF表達水平與HR-HPV感染及宮頸病變程度的相關(guān)性分析

2.6 PD-1、PD-L1、MIF在宮頸組織中陽性表達顯微鏡染色圖片。見圖1。

圖1 a、b、c分別為PD-1、PD-L1、MIF在宮頸組織中陽性表達的顯微鏡染色圖片

3 討論

HPV是球形DNA病毒感染引起的一種性傳播疾病，可能導(dǎo)致腫瘤或尖銳濕疣或皮膚的黏膜的贅生物[8]。HPV病毒有兩百種左右的亞型，人的皮膚和黏膜最常見的感染大概有幾十種，根據(jù)它引起癌變的風(fēng)險可分為高危型和低危型[9]。持續(xù)性的、高危型的HPV感染是宮頸癌和宮頸癌前病變發(fā)生的重要原因[10]。臨床治療宮頸癌是以化療、放療、手術(shù)治療等綜合治療為主，近年來細胞免疫治療引起了越來越多醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸組織病變的進展PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈增高趨勢，組間比較有差異，且PD-1、PD-L1、MIF在SCC組表達水平顯著高于其他三組。分析可能的原因是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族。PD-L1是一種跨膜蛋白，免疫系統(tǒng)的抑制有關(guān)[11]。PD-1與PD-L1結(jié)合，可以傳導(dǎo)抑制性的信號，減低淋巴結(jié)CD8+T細胞的增生，而且PD-1還可以借由調(diào)節(jié)Bcl-2基因，控制淋巴結(jié)中抗原特異性T細胞的聚積，促進腫瘤的免疫逃逸[12]。MIF是一種內(nèi)分泌免疫物質(zhì)，能夠限制體內(nèi)巨噬細胞的活動，有助于腫瘤細胞的增殖[13]。這點與PD-1、PD-L1、MIF的陽性表達在宮頸炎、低級別上皮內(nèi)病變、高級別上皮內(nèi)病變、宮頸癌患者依次增高可以得到印證。研究發(fā)現(xiàn)四組不同程度的宮頸病變HR-HPV陽性率分別為31.91%、65.12%、83.87%、100.00%，HR-HPV陽性率隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的加重而升高，組間比較差異顯著。HPV/hr是指高危型HPV，檢查有高危型HPV陽性，需要進一步做HPV分型檢查，明確是否有HPV16、18這兩個亞型感染。如果HPV16/18陽性，需要進一步做陰道鏡檢查+宮頸活檢，明確是否有宮頸病變。在有性生活的女性中，HPV感染很普遍，最初可以誘導(dǎo)女性發(fā)生低級別的鱗狀上皮內(nèi)病變，其中大部分在機體免疫應(yīng)答中清除，少部分會進展為宮頸癌。如果檢查結(jié)果是其他高危型HPV陽性，但是TCT檢查結(jié)果是正常的，可以定期復(fù)查，每年做一次宮頸TCT和HPV檢查。提示HR-HPV是宮頸病變發(fā)生的重要原因，與當(dāng)前國內(nèi)外研究基本一致[14]。研究發(fā)現(xiàn)HR-HPV(+)組的PD-1、PD-L1、MIF表達水平高于HR-HPV(-)組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。HPV感染后，大多數(shù)患者可以通過自身的免疫調(diào)節(jié)進行清除，少數(shù)患者會持續(xù)感染，發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤，甚至癌變。近來不少研究顯示機體免疫調(diào)節(jié)對HPV引發(fā)的致癌過程至關(guān)重要，HPV能夠逃避免疫監(jiān)視，與PD-1、PD-L1、MIF細胞免疫因子在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用有很大關(guān)系。有研究認(rèn)為HPV可能與細胞免疫因子共同促進癌癥的演變[15]。PD-1與PD-L1結(jié)合可以抑制T細胞增殖，并促進T細胞凋亡，提高CD8細胞毒性T細胞功能，促進抗腫瘤免疫應(yīng)答。Spearman相關(guān)性分析，HR-HPV感染與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關(guān)，宮頸病變程度與PD-1、PD-L1、MIF表達水平呈正相關(guān)。提示PD-1、PD-L1、MIF與HPV感染和宮頸病變進程密切相關(guān)，對宮頸癌的診斷與預(yù)防具有主要的參考價值。

綜 上 所 述，PD-1、PD-L1、MIF表 達 水 平 與HR-HPV感染及宮頸病變程度呈正相關(guān)，表明PD-1、PD-L1、MIF表達可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，定期檢測對患者的病情發(fā)展具有一定的指導(dǎo)作用。