IL-17基因多態(tài)性與原發(fā)性膽汁性膽管炎易感相關(guān)性研究

譚為民，李佳，黃清水,王睿，周子聞，李彩嬌

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科；2.南昌大學(xué)在校本科生科研訓(xùn)練項目小組，江西 南昌 330006）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）原稱為原發(fā)性膽汁肝硬化（Primary biliary cirrhosis,PBC），是一種以中小膽管持續(xù)性非化膿性炎癥浸潤及膽汁淤積為主要特征的自身免疫病[1]。當前臨床對PBC尚無特效的治療方法，早期診斷及熊脫氧膽酸治療方案的應(yīng)用可以明顯改善膽汁淤積癥狀及預(yù)后，但卻不能阻斷疾病進程，晚期唯一治療選擇是進行肝移植，嚴重危害患者的生命健康[2]。血清抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibodies，AMAs）陽性是PBC特異性血清診斷指標，AMAs主要靶抗原是線粒體自身抗原丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase E2 subunit，PDC-E2）[1，3]。該病患者以30歲以上中老年女性為主（男∶女約為1∶9）[4-5]，確切發(fā)病機制不清，可能與環(huán)境因素、遺傳因素、病毒和細菌感染、自身抗體、雌激素、免疫調(diào)控、趨化因子、抗原呈遞細胞、自噬、衰老、凋亡等有關(guān)，遺傳因素和炎癥因素是其重要發(fā)病因素[6-7]。

IL-17作為一類重要的炎癥因子家族，主要由Th17細胞分泌產(chǎn)生，在各類自身免疫病炎癥細胞聚集及浸潤中起關(guān)鍵作用。IL-17家族包括六個家族成員，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F[8]。IL-17A和IL-17F作為其中重要的炎癥因子，起著主要的炎癥作用[9]。研究表明，PBC組較健康對照組IL-17A表達顯著升高，與疾病嚴重程度成正相關(guān)[10]。IL-17多個SNPs突變位點與自身免疫病易感性相關(guān)，IL-17A G-197A(rs2275913)位點多態(tài)性被證明與類風濕關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)[11]，中東地區(qū)結(jié)直腸研究中，IL-17A rs2275913位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風險存在相關(guān)性，IL-17A rs2275913基因表達豐度能作為結(jié)直腸癌早期監(jiān)測的基因信號[12]。一項關(guān)于亞洲人群胃癌風險與IL-17位點多態(tài)性研究顯示，IL-17A rs2275913和IL-17F rs763780兩個基因位點多態(tài)性與胃癌風險高度相關(guān)[13]。而關(guān)于IL-17相關(guān)SNPs位點基因突變和基因型是否與PBC易感性相關(guān)，尚未有學(xué)者進行相關(guān)研究。

IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個相關(guān)SNP位點是IL-17基因重要功能區(qū)位點。該研究擬在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院PBC患者中分析IL-17 SNPs基因位點突變和基因型分布，在基因水平探討IL-17 SNPs位點多態(tài)性與PBC疾病易感相關(guān)性。明確PBC患者血清中IL-6、IL-12、IL-17細胞因子表達水平，分析其與健康對照組的表達差異。分析相關(guān)SNPs位點基因型與細胞因子表達間的關(guān)系，為PBC易感危險因素的診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 研究納入2018年1月至2020年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院就診的PBC患者，同時收集該醫(yī)院同時間段體檢科健康對照組全血和血清標本。本研究共納入56位PBC患者，60位健康人。由于PBC患者是零星出現(xiàn)的，主要采取“LIS系統(tǒng)查找-符合標準PBC患者全血和血清標本收集-患者信息錄入Excel表格-全血及血清標本凍存待用”的策略。匹配收集的PBC患者年齡和性別，收集相對應(yīng)健康組全血及血清標本，兩周內(nèi)完成收集。納入研究的PBC研究病例對象均經(jīng)過臨床專業(yè)醫(yī)師的診斷，并且為初次診斷的患者。

依據(jù)2017年歐洲肝臟研究協(xié)會（European Association for the Study of the Liver,ESAL）中PBC的診斷標準[14]。PBC患者納入標準需符合以下三條標準中至少兩條：（1）抗線粒體抗體（AMAs）滴度大于1∶40[15]；（2）堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）或谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）濃度大于正常濃度上限的1.5倍，且持續(xù)時間大于24周；（3）典型的病理切片結(jié)果（如典型的中小膽管上皮細胞破壞或中小膽管炎癥浸潤情況）。

排除標準：（1）病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝癌；（2）近期患有嚴重傳染病和心血管疾病的；（3）接受免疫抑制藥物、增強藥物治療；（4）自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)、原發(fā)性硬化性膽管炎(Primary sclerosing cholangitis,PSC)與自身免疫性肝病重疊綜合征。

所有符合標準的PBC患者和健康組均按照規(guī)范采血要求進行操作?？鼓瞎苋獦吮痉盅b后做好標記，血清標本離心分離后分裝，均保存于-80℃的低溫科研冰箱中，避免對血液標本進行反復(fù)凍融。

1.2 DNA提取 嚴格按照北京天根生物技術(shù)有限公司的全血DNA提取試劑盒操作說明，提取PBC組和健康對照組抗凝全血中的DNA。提取的DNA的濃度和純度使用Quwell Q3000進行測定，OD 260/OD 280比值介于1.6～1.8符合標準，DNA標本保存于-20℃冰箱。

1.3 目的位點基因分型 相應(yīng)的IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780位點SNPs由Sanger測序進行確定。為擴增出對應(yīng)位點的目的DNA片段，Primer軟件設(shè)計四對引物，見表1，由上海生工進行合成。25μL PCR反應(yīng)體系由5μL DNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，12.5μL GoTaq Green PCR mix混合液和3.5μL去核酸水組成。擴增條件：95℃變性5 min，每次95℃變性30 s進行35次循環(huán)，退火1 min，對應(yīng)引物退火溫度見表1，72℃延伸90 s每循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃冷藏。所有PCR擴增目的片段送到上海生工進行Sanger測序。

表1 對應(yīng)位點引物及T m溫度

1.4 細胞因子和臨床指標測定 -80℃低溫冰箱保存的PBC組和健康對照組血清置于37℃溫箱進行解凍，融化混勻，離心去除雜質(zhì)沉淀。流式細胞術(shù)測定兩組血清IL-6、IL-12、IL-17表達水平，嚴格按照細胞因子檢測試劑盒操作步驟進行。并同時收集兩組對應(yīng)的血液和生化臨床指標，進行分析研究。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)均以（±s）表示。F檢驗方差齊性，P＞0.05時，組間比較采用獨立樣本t檢驗，否則采用U檢驗。Haploview 4.2軟件用來分析哈溫平衡。線性相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。分類數(shù)據(jù)采用Pearson卡方檢驗，單因素logistic回歸分析IL-17 SNPs與PBC易感相關(guān)性，以O(shè)R值和95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBC組和健康對照組臨床基本特征 56例PBC患者平均發(fā)病年齡為（56.25±14.59）歲，以中老年女性為主，男性患者14例，女性患者42例。匹配PBC患者年齡和性別收集健康人基本臨床信息，比較發(fā)現(xiàn)，PBC組的紅細胞（Red blood cell,RBC）、血 紅 蛋 白 （Hemoglobin,HGB）、血 小 板（Platelets,PLT）及血細胞比容（Hematocrit,HCT）數(shù)值顯著低于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。生化指標方面，總蛋白（Total protein,TP）、白蛋白（Albumin,ALB）、A/G指標PBC組顯著低于健康對照組，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、A/G指標PBC組顯著高于健康對照組，尤其是生化指標中反應(yīng)膽汁淤積情況的指標谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、總膽紅素（Total bilirubin,TBIL）、直接膽紅素（Direct bilirubin,DBIL），PBC顯著高于健康對照組。ALP指標PBC組是健康組的3.2倍，GGT指標PBC組是健康組的5.5倍，TBIL指標PBC組是健康組的3.3倍，DBIL指標PBC組是健康組的12.9倍，PBC組均遠高于健康對照組，見表2。

表2 PBC組與健康對照組基本臨床特征

2.2 PBC組和健康對照組IL-17 SNPs位點突變和基因型分析 PBC組和健康對照組IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780四個SNPs位點基因型進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)基因平衡分析，兩組四個SNPs基因型P＞0.05時，分布符合哈-溫平衡，具有研究意義，見表3。

表3 PBC組和健康對照組哈迪-溫伯格平衡檢驗結(jié)果

對兩組四個SNPs位點基因型和基因頻率進行顯性模型、隱性模型、共顯性模型分析。IL-17A rs10484879和IL-17F rs763780基因位點三種基因型模型中，PBC組和健康對照組表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-17A rs2275913位點隱性模型和共顯性模型中，PBC組基因型AA表達少于健康人群中AA表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隱性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.383，（0.157～0.935）；共顯性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.330，（0.109～0.998）。IL-17A rs3819025位點顯性模型和共顯性模型中，PBC患者GA和AA基因型遠多于健康人這兩種基因型表達，GG基因型表達少于健康人表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。顯性模型中，GA+AA基因型組合OR值和95%CI分別為11.600，（2.527～53.259）；共顯性模型中，GA基因型OR值和95%CI分別為10.150，（2.186～47.127）。PBC組和健康組突變位點基因型和等位基因表達和頻率，見表4。

表4 PBC組和健康對照組基因型和基因頻率分析結(jié)果

2.3 PBC組和健康對照組細胞因子表達水平 分析兩組血清中IL-6、IL-12、IL-17A表達水平，PBC組均顯著高于健康對照組，見表5。通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PBC組中IL-17A表達與IL-6表達成正相關(guān)（r=0.4818,P=0.0003）,圖1，也與IL-12表達成正相關(guān)（r=0.3714,P=0.0048）,圖2。IL-6表達水平未發(fā)現(xiàn)與IL-12表達水平存在相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 PBC組IL-17A與IL-6表達相關(guān)性

圖2 PBC組IL-17A與IL-12表達相關(guān)性

表5 PBC組和健康組細胞因子表達水平

2.4 PBC組IL-17A rs3819025位點不同基因型細胞因子及生化指標表達 分析IL-17A rs3819025位點不同基因型細胞因子及生化指標表達差異，見表6。反應(yīng)膽汁淤積指標TBIL、DBIL、ALP、GGT，AA+GA基因型人群均高于GG型人群。IL-17A表達水平AA+GA基因型人群也高于GG型人群。IL-6、IL-12表達水平AA+GA基因型人群低于GG型人群，但所有差異不存在統(tǒng)計學(xué)意義。

表6 PBC組細胞因子及生化指標不同基因型表達

3 討論

收集2018年1月至2020年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診PBC患者56例納入研究，并匹配其年齡和性別收集60例健康對照組。分析可知，江西PBC患者以中年女性為主，平均患者年齡（56.25±14.59）歲，男女比例為1∶3。近幾年流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著醫(yī)療水平提高PBC確診率的提高，PBC患者男女比例有所增加，甚至有調(diào)查PBC患者男女比例為1∶2.1[16]，這與該研究分析結(jié)果較為符合。比較兩組肝生化指標，PBC較健康對照組ALT、AST指標顯著升高，ALT約為對照組4倍，AST約為對照組5倍。慢性肝炎尤其是肝纖維化時，AST升高程度高于ALT升高程度[17]。PBC患者肝損傷為慢性肝炎，且可能進展為肝纖維化。PBC患者易出現(xiàn)黃疸、瘙癢、疲憊等并發(fā)癥。比較兩組DBIL、IBIL和TBIL指標，PBC組三項指標均顯著升高，以DBIL升高尤甚，約為健康對照組的16倍，IBIL約為健康組2倍，PBC患者以膽汁淤積梗阻性黃疸為主。PBC組ALP指標約為健康對照組4倍，PBC組GGT指標約為健康對照組7倍。ALP高于正常值上限1.5倍，是確診PBC的條件之一[14]。ALP升高不僅僅出現(xiàn)在膽汁淤積性肝病中，還有諸多生理性或病理性原因可引起ALP升高[18]（如骨骼性疾病，青少年生長期，婦女妊娠期等）。臨床上通常結(jié)合GGT指標和DBIL判斷患者膽汁淤積情況，并結(jié)合AMAs陽性用于確診PBC[19]。綜上所述，PBC患者中小膽管的損傷，造成患者出現(xiàn)以DBIL升高為主，IBIL輕微升高為特征的膽汁淤積性黃疸，引起ALP、GGT指標升高，導(dǎo)致肝臟的慢性炎癥損傷，肝臟蛋白合成能力受損，白蛋白合成下降，持續(xù)存在的肝臟炎癥可能引起肝臟纖維化?；颊唧w內(nèi)免疫系統(tǒng)激活，相應(yīng)IgG和IgM抗體合成增加，GLB升高明顯。

PBC作為一種復(fù)雜的自身免疫病，盡管其發(fā)病機制尚未闡明，但我們已經(jīng)認識到遺傳因素、免疫因素和炎癥因素在PBC發(fā)病中起重要作用[20]。作為關(guān)鍵的促炎因子之一，IL-17A相關(guān)SNPs在多種自身免疫病研究中已被證明與疾病易感性存在相關(guān)性，但結(jié)果各異[21-22]。IL-17A位于人染色體6q21，由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成[23]，有關(guān)IL-17A基因位點多態(tài)性與PBC易感相關(guān)性分析鮮有研究。本研究分析IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個SNPs位點與PBC易感相關(guān)性。首先對兩組四個SNPs位點基因型分布進行哈-溫平衡檢測，其分布頻率均符合哈-溫平衡，說明兩組基因均無群體偏差，具有人群代表性。PBC組和健康組中，rs10484879和rs763780 SNPs位點基因突變和基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)差異，這兩個SNPs位點基因突變與PBC易感性不存在相關(guān)性。

IL-17A rs2275913 SNPs位點中野生型等位基因為G，A為其突變型等位基因。在隱性模型和共顯性模型中，PBC組AA基因型攜帶者均少于健康對照組AA攜帶者。隱性模型中，GA和GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的2.61倍；共顯性模型中，GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的3.03倍。提示AA基因型攜帶者PBC易感性降低，AA基因型可能是PBC保護基因型。IL-17A rs2275913位點突變型A等位基因可能為PBC保護因素。

IL-17A rs3819025 SNPs位點，PBC患者突變型基因位點A顯著多于健康對照組。顯性模型中，PBC組GA+AA基因型頻率顯著高于健康對照組中出現(xiàn)頻率，GA+AA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的11.60倍；共顯性模型中，GA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的10.15倍。提示rs3819025 SNPs位點A等位基因突變，會增加PBC疾病易感性，GA和AA基因攜帶者具有更高的PBC患病風險。IL-17A rs3819025 SNPs位點突變型A等位基因會顯著增加PBC易感性，是PBC危險因素。

分析rs3819025 SNPs位點不同基因型生化指標，AA+GA基因型ALP、GGT、TBIL、DBIL指標較GG基因型表達水平升高，提示A突變有可能與PBC中膽汁淤積有關(guān)。分析rs3819025 SNPs位點不同基因型細胞因子表達，GA+GA基因型較GG基因型IL-17表達水平升高，提示IL-17A rs3819025位點突變有可能會增強IL-17相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性，進而促進IL-17表達，并進一步引起其他多種細胞因子表達差異。而相關(guān)作用機制需要后續(xù)研究進一步探索?？偠灾琁L-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點多態(tài)性與PBC易感性相關(guān)。rs2275913位點AA基因型攜帶者PBC易感性較低，rs3819025位點GA和AA基因型攜帶者易發(fā)生PBC。IL-17 SNPs多態(tài)性可能作為預(yù)防診斷PBC的候選基因，從而為PBC早期診斷和預(yù)防提供相應(yīng)依據(jù)。

比較兩組炎癥細胞因子IL-6、IL-12和IL-17A表達水平，PBC組三者表達均高于健康對照組。分析可知，PBC中IL-17A的表達與IL-6和IL-12的表達成正相關(guān)，炎癥因子在PBC病情進展相互影響，影響各自的分泌產(chǎn)生。分析PBC組rs3819025 SNPs位點不同基因型對細胞因子和生化指標的影響，GA+AA突變型基因型較GG野生型基因型IL-17表達水平升高，相關(guān)膽汁淤積和肝損傷指標表達也有所升高。但由于可能納入研究標本量較少，所有差異均不存在統(tǒng)計學(xué)意義，需后續(xù)研究擴大樣本量驗證。

該研究提示，IL-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點多態(tài)性可能與PBC易感性相關(guān)。rs2275913位點AA基因型攜帶者PBC易感性較低，是PBC發(fā)病保護因素；rs3819025位點GA和AA基因型攜帶者易發(fā)生PBC，是PBC發(fā)病危險因素。IL-17 SNPs多態(tài)性研究可為PBC早期診斷和預(yù)防提供預(yù)測依據(jù)。