抑制PERK/e IF2α通路對(duì)七氟醚誘發(fā)POCD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和α-突觸核蛋白的影響

苗亞飛，楊木強(qiáng)，司馬靚杰，閆俊強(qiáng)

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471003；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 洛陽(yáng) 471003）

雖然七氟醚是一種穩(wěn)定、安全的麻醉誘導(dǎo)劑，但是最近研究發(fā)現(xiàn)七氟醚會(huì)損傷神經(jīng)元，誘發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Postoperative cognitive dysfunction，POCD），甚至導(dǎo)致永久性的神經(jīng)功能損傷以及帕金森癥等[1]，α-突觸核蛋白（α-Syn）是參與帕金森的重要蛋白，在POCD中也起著促進(jìn)作用[2]。目前研究認(rèn)為海馬神經(jīng)元受損是患者神經(jīng)功能、記憶力減退的重要原因，而由各種原因引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)會(huì)誘發(fā)海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng) 激（Endoplasmic reticulum stress，ERS），進(jìn) 而 導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和功能障礙[3]。PERK/eIF2α通路是調(diào)節(jié)ERS的關(guān)鍵通路，并且有研究顯示麻醉會(huì)引起PERK水平的升高，并且抑制ERS反應(yīng)可緩解麻醉小鼠的POCD，并抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[4]。本文主要分析抑制PERK/eIF2α通路對(duì)七氟醚誘發(fā)大鼠POCD、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和α-Syn的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 Sprague-Dawley（SD）大鼠（清潔級(jí)，雄性。20周，350～400 g，河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）。七氟醚（Abbvie公司，美國(guó)）。PERK/eIF2α通路抑制劑GSK2606414（Selleck公司，美國(guó)）。110 SE型小動(dòng)物麻醉機(jī)（Ohmeda公司，美國(guó)）。水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（泰盟科技有限公司，中國(guó)）。TUNEL凋亡試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）。anti-PERK、anti-eIF2α、anti-Caspase-3、anti-CHOP、anti-α-Syn（Abcam公司，美國(guó)）。PVDF膜（Bio-Rad公司，美國(guó)）。ECL試劑盒（Amersham，美國(guó)）。顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 分組、建模和干預(yù)方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、七氟醚組和GSK2606414組（N=8）。七氟醚組和GSK2606414組參考文獻(xiàn)通過(guò)七氟醚建立SD大鼠POCD模型[5]，主要步驟如下：SD大鼠禁食禁飲8 h后放置在連接麻醉機(jī)的大小為60 cm×30 cm×25 cm透明麻醉箱內(nèi)，另一側(cè)通道連接連接氣體監(jiān)測(cè)儀。七氟醚的麻醉濃度為2%，氧流量為3 L/min，連續(xù)4 h。對(duì)照組大鼠進(jìn)行同樣的處理但不吸入七氟醚。GSK2606414組大鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]使用GSK2606414進(jìn)行干預(yù)，在吸入七氟醚6 h前用GSK2606414灌胃，劑量為150 mg/kg，對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃。吸入七氟醚后4 h進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，然后腹腔注射戊巴比妥（劑量為2 mL/kg，濃度為20 g/L）麻醉并處死大鼠，取出海馬體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 Western blot檢測(cè)蛋白 在液氮下將海馬體研磨并用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌，裂解后萃取總蛋白，將蛋白樣本與角質(zhì)酶II混合并進(jìn)行SDSPAGE分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后封閉，在PDVF膜中加入anti-PERK、anti-eIF2α、anti-Caspase-3、anti-CHOP、anti-α-Syn（1:500稀釋）在4°C孵育過(guò)夜，然后加入1∶5 000稀釋的二抗（1 h，室溫）。ECL試劑盒可視化蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。紋狀體中α-突觸核蛋白水平檢測(cè)方法與此相同。

1.4 水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力 通過(guò)水迷宮視頻跟蹤[7]和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)[8]檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于水迷宮實(shí)驗(yàn)，逃避潛伏期越長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。對(duì)于跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)期和實(shí)驗(yàn)期錯(cuò)誤次數(shù)越高、潛伏期越長(zhǎng)提示學(xué)習(xí)能力越差。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)凋亡 將海馬體組織固定并透化，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，然后將其放置于TUNEL溶中，在37℃下孵育1 h。洗滌后加入Converter-POD溶液孵育30 min。之后依次進(jìn)行顯色、DAPI染色細(xì)胞核，然后進(jìn)行封片。通過(guò)檢測(cè)熒光反應(yīng)計(jì)算凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)設(shè)立3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19軟件。 進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 GSK2606414對(duì)PERK/eIF2α通路的影響 七氟醚組的PERK和eIF2α水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），GSK2606414組的PERK和eIF2α水平顯著低于七氟醚組（P＜0.05），提示GSK2606414可有效抑制PERK/eIF2α通路，見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組PERK/e IF2α通路比較

圖1 Westernblot檢測(cè)GSK2606414對(duì)PERK/e IF2α通路的影響

2.2 GSK2606414對(duì)神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力的影響與對(duì)照組比較，七氟醚組的逃避潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期顯著升高而穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低（P<0.05），GSK2606414組的逃避潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期顯著低于七氟醚組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于七氟醚組（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 GSK2606414對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響 如圖2，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。對(duì)照組海馬神經(jīng)元凋亡率為（1.25±0.35）%，七氟醚組的凋亡率為（16.23±2.85）%，顯著高于對(duì)照組，GSK26 06414組凋亡率為（7.83±1.68）%，顯著低于七氟醚組（P<0.05）。

圖2 TUNEL檢測(cè)GSK2606414對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響

2.4 GSK2606414對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和α-Syn水平的影響 七氟醚組海馬體組織的CHOP、Caspase-3和α-Syn水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），GSK2606414組的CHOP、Caspase-3和α-Syn水平顯著低于七氟醚組（P<0.05），見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和α-S y n水平比較

圖3 Western blot檢測(cè)GSK2606414對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和α-Syn水平的影響

3 討論

近年來(lái)，外科手術(shù)得到了迅猛發(fā)展，患者對(duì)于手術(shù)安全性和舒適性的也要求提高，七氟醚具有快速誘導(dǎo)麻醉、對(duì)肝和腎功能影響小及穩(wěn)定的血液動(dòng)力學(xué)等特點(diǎn)，在麻醉中廣泛使用。但是過(guò)往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了七氟醚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，可能會(huì)出現(xiàn)POCD，甚至影響兒童的智力和記憶力，引起帕金森癥等，分析POCD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義[9]。

海馬體神經(jīng)元的損傷是引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙的主要原因，研究顯示七氟醚會(huì)引起海馬體神經(jīng)元凋亡，從而引起POCD[10]。氧化應(yīng)激反應(yīng)在其中起著重要作用，研究顯示七氟醚可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激引起海馬體神經(jīng)元凋亡[11]。PERK/eIF2α通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，研究顯示PERK/eIF2α通路的激活與POCD有關(guān)[12]。七氟醚也具有激活PERK/eIF2α通路的作用[13]，據(jù)此我們推測(cè)七氟醚可能通過(guò)PERK/eIF2α通路參與POCD的發(fā)生。在本次研究中，我們通過(guò)吸入七氟醚建立大鼠POCD模型，然后通過(guò)GSK2606414抑制PERK/eIF2α通路。結(jié)果顯示模型組大鼠海馬體中PERK/eIF2α水平顯著升高，而GSK2606414可以顯著一直POCD大鼠的PERK/eIF2α通路。此外，七氟醚組的PERK/eIF2神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力降低，海馬體的細(xì)胞凋亡率，GSK2606414組神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力高于七氟醚組，海馬體的細(xì)胞凋亡率低于七氟醚組。這提示在七氟醚引起的POCD大鼠模型中，PERK/eIF2α通路被激活，而抑制PERK/eIF2α通路可以緩解七氟醚對(duì)海馬體凋亡和神經(jīng)功能、學(xué)習(xí)能力的影響。

為進(jìn)一步分析PERK/eIF2α通路在七氟醚引起的POCD大鼠模型中的作用機(jī)制，檢測(cè)了ERS和α-Syn的水平。PERK/eIF2α通路可以直接調(diào)節(jié)ERS，ERS是是細(xì)胞對(duì)外界壓力或損傷的早期或初始反應(yīng)，并與神經(jīng)元損傷或死亡有關(guān)，如阿爾茨海默癥、帕金森癥等，研究顯示了氧化應(yīng)激引起的ERS與老年患者POCD[14]。而PERK/eIF2α通路的激活也會(huì)引起α-Syn的上調(diào)，也會(huì)參與ERS[15]。本次研究結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，七氟醚組的α-Syn和質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白CHOP、Caspase-3水平顯著升高，GSK2606414組α-Syn、CHOP、Caspase-3水平顯著低于七氟醚組。有研究顯示七氟醚會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)PERK/eIF2α通路引起超結(jié)構(gòu)ER交替和ER應(yīng)激活化，而ERS會(huì)促進(jìn)CHOP、Caspase-3蛋白的升高，引起凋亡[16]。α-Syn與腦部神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)，研究顯示α-Syn可以倍七氟醚和PERK誘導(dǎo)，抑制ERK/eIF2α通路會(huì)減少α-Syn的表達(dá)保護(hù)腦神經(jīng)[17-18]。本次研究結(jié)果顯示抑制PERK/eIF2α通路可以抑制七氟醚引起的海馬體ERS和α-Syn的表達(dá)。

綜上所述，七氟醚會(huì)引起PERK/eIF2α通路、ERS和α-Syn的上調(diào)，而抑制PERK/eIF2α通路會(huì)顯著抑制ERS和α-Syn的表達(dá)，緩解海馬體神經(jīng)元的凋亡。但是關(guān)于吸入七氟醚通過(guò)PERK/eIF2α通路調(diào)節(jié)ERS和α-Syn的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。