固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素微量殘留

郭偉偉，孫志洪

(1. 滄州市生態(tài)環(huán)境監(jiān)控中心，河北 滄州 061000; 2. 河北省滄州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，河北 滄州 061000)

0 引 言

我國是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)品貿(mào)易的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)已成為我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)品貿(mào)易發(fā)展的穩(wěn)壓器。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在我國發(fā)展歷史十分悠久，早在北宋時(shí)期我國就有開展水產(chǎn)養(yǎng)殖的記載，水產(chǎn)養(yǎng)殖主要有淡水養(yǎng)殖、海水養(yǎng)殖和循環(huán)水養(yǎng)殖3種，其中淡水養(yǎng)殖在我國南、北方地區(qū)均大量存在，淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品種主要有：鯽魚、鱸魚、蝦、蟹等品種，均是我國老百姓餐桌上的美食[1-3]。水產(chǎn)品在養(yǎng)殖的過程中，為提高單位養(yǎng)殖密度和減少病蟲害，養(yǎng)殖戶常在養(yǎng)殖過程中使用抗生素、殺菌劑等，近些年，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?；鹊陌l(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)出現(xiàn)了一些被老百姓關(guān)注的問題，如抗生素超標(biāo)、重金屬超標(biāo)等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[4-8]?？兹甘G是一種三苯甲烷類工業(yè)染料，氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素等抗生素，因其價(jià)格便宜，且具有殺菌、消毒的作用，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常有使用。人們誤食用被該類藥物污染的水產(chǎn)品時(shí)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)抗生素殘留增加，尤其對(duì)嬰幼兒影響較大，輕者產(chǎn)生耐藥性，重者可能導(dǎo)致藥物中毒[9-12]。因此，加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素的監(jiān)測(cè)，可以有效保護(hù)水產(chǎn)養(yǎng)殖用水資源、合理指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

現(xiàn)階段，許多學(xué)者針對(duì)地表水和水產(chǎn)品中孔雀石綠、氧氟沙星等進(jìn)行了研究，如：王金秀、任蘭正等研究了離子液體萃取-分光光度法測(cè)定水樣中的孔雀石綠殘留的分析方法[13]，馮濤、鄔玲玲等研究了高效液相熒光法測(cè)定養(yǎng)殖水產(chǎn)中恩諾沙星等四種氟喹諾酮類藥物殘留[14]，關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素微量殘留的研究不多，其中分光光度法和液相色譜法專屬性較差、且靈敏度偏低，不適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中極微量藥物殘留的監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)研究一種采用固相萃取提取、凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素殘留，液相色譜-質(zhì)譜法定量、定性檢測(cè)的分析方法[15]，實(shí)驗(yàn)證明，此方法靈敏度高、重復(fù)性好，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用水中孔雀石綠及其代謝物、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素殘留的監(jiān)測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A型超高壓液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；LCMS-8030型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本 SHIMADZU公司）；博納艾杰爾Qdaura SPE-40型全自動(dòng)固相萃取儀（天津Agela Technologies公司）；梅特勒ME 203E型電子天平（萬分之一，瑞士mettler-toled公司）；L-148型水浴氮吹儀（北京來亨科技公司）；沃特世HLB固相萃取柱（規(guī)格：500 mg，12 mL，美國 Waters公司）；QL-901型渦旋振蕩器（上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；Milliplus 2150型超純水系統(tǒng)（美國millipore公司）。

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為1ST7301-100M，濃度為100 μg/mL；隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為1ST7303-100M，濃度為 100 μg/mL；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為 BWQ8055-2016，濃度為 100 μg/mL；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為1ST4107-100M，濃度為100 μg/mL；土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：編號(hào)為 1ST4111-100M，濃度為100 μg/mL，均購自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院。

乙酸銨、甲酸：分析純，含量均大于99.0%，購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；甲醇、乙腈：色譜純，含量均大于99.999%，購自美國天地試劑公司；實(shí)驗(yàn)所有用水均為超純水。

1.2 溶液制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為100 μg/mL），準(zhǔn)確移取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（濃度為10 μg/mL）；同法取隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（濃度均為10 μg/mL）。

1.2.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別取1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，精密吸取適量，置同一支50 mL容量瓶中，加甲醇制備每1 mL溶液含有孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素分別為 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.2.3 樣品溶液的制備

樣品收集：隨機(jī)在水產(chǎn)養(yǎng)殖廠采集水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣2 L，過濾，去除肉眼可見異物，置棕色容量瓶中，儲(chǔ)存條件4 ℃，該溶液在24 h內(nèi)有效。

前處理：取收集后的水樣，調(diào)節(jié)水樣溫度至室溫，加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后將該水樣倒入固相萃取儀樣品儲(chǔ)存瓶中，置樣品架上；另取HLB固相萃取小柱，按設(shè)定的樣品位置，將固相萃取小柱依次置固相萃取儀中，首先將固相萃取小柱進(jìn)行活化（分別用12 mL純化水、12 mL甲醇和12 mL正己烷活化萃取小柱）；設(shè)定程序，將上述水樣 1 L，以 15 mL/min 的流量，過固相萃取柱，最后用15 mL 50%甲醇洗脫，收集洗脫液；最后將洗脫液氮吹至近干（45 ℃條件），再加甲醇定容至1 mL，混勻，即得。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜方法

色譜柱：Waters Acquity BEH UPLC-C18（規(guī)格：100 m × 2.1 mm, 2.1 μm）；柱溫度：35 ℃；柱流量：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相 A：0.1% 甲酸的水溶液，流動(dòng)相B：1 mmol/L乙酸銨的甲醇溶液；洗脫模式：梯度洗脫。洗脫表見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜方法

掃描方式：ESI+正離子模式；離子源：電噴霧離子源；電噴霧電壓：4500 V；離子源溫度：560 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；輔助氣壓力：72 psi(1 psi=6.895 kPa)；氣簾氣壓力：31 psi；碰撞氣：氮?dú)猓ǖ獨(dú)獍l(fā)生器制備）；檢測(cè)模式：MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式）。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的確定

水樣中獸藥和禁用藥物殘留監(jiān)測(cè)的前處理方法主要有：QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)凈化法、凝膠凈化色譜法和固相萃取法等。QuEChERS凈化法，需要將水樣進(jìn)行濃縮后進(jìn)行提取和凈化，濃縮過程易造成目標(biāo)物的損失或分解，準(zhǔn)確度偏低；凝膠凈化色譜法，前處理色譜條件需要優(yōu)化，操作步驟繁瑣，試劑耗用量大，且儀器價(jià)格較高，方法適用性較差；固相萃取法，無需對(duì)樣品進(jìn)行濃縮，且操作步驟簡單，準(zhǔn)確度較高，方法更易推廣使用。實(shí)驗(yàn)取孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素加標(biāo)濃度均為0.05 μg/mL的混合溶液，分別采用上述3種方法進(jìn)行前處理，保持其他條件不變，考察3種前處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。結(jié)果，凝膠凈化色譜法和固相萃取法回收率優(yōu)于QuEChERS凈化法，考慮到固相萃取法的優(yōu)勢(shì)，最終確定固相萃取法為前處理方法。比較結(jié)果見表2。

表2 3種前處理方法回收率比較

2.2 固相萃取柱類型的確定

固相萃取柱在整個(gè)前處理過程中，對(duì)目標(biāo)物的富集、凈化、洗脫起到關(guān)鍵作用，因此選擇適合的固相萃取柱，可以有效提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度、降低基質(zhì)干擾等?？兹甘G、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素5種目標(biāo)物，其中孔雀石綠、隱色孔雀石綠極性較弱，氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素極性均偏中等強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)分別選擇HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱、C18固相萃取柱和氨基固相萃取柱（規(guī)格均為 500 mg，12 mL），保持其他條件不變，分別更換上述4種類型固相萃取柱，考察對(duì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素加標(biāo)濃度均為0.05 μg/mL的混合溶液的回收率影響。結(jié)果如表3，選擇HLB固相萃取柱時(shí)，5種目標(biāo)物回收率最佳。因此實(shí)驗(yàn)選擇HLB固相萃取柱作為前處理小柱。

表3 4種固相萃取柱回收率比較

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別配制質(zhì)量濃度為150 ng/mL的單標(biāo)測(cè)試溶液。分別將上述單標(biāo)測(cè)試溶液，選擇儀器模式為質(zhì)譜模式，找到5種目標(biāo)物的母離子，再以合適的碰撞能量將母離子擊碎，得到母離子對(duì)應(yīng)的子離子，選擇響應(yīng)較高的1個(gè)子離子作為定量離子，另選1個(gè)子離子作為定性離子，根據(jù)母離子對(duì)應(yīng)的2個(gè)子離子對(duì)，優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓，建立上述5種目標(biāo)物的MRM監(jiān)測(cè)方法。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表4。

表4 質(zhì)譜參數(shù)結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取 1.2.2 項(xiàng)下 0.002，0.02，0.2，1.0，2.0，4.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3色譜和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定3次，取平均值，再以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；最后逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信號(hào)噪音比值計(jì)算檢出限。結(jié)果見表5，典型譜圖見圖1。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程及檢出限

圖1 典型質(zhì)譜圖

2.5 回收率試驗(yàn)

取水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣品（樣品&3，本底中恩諾沙星含量為0.039 μg/mL），過200目篩網(wǎng)，去除肉眼可見異物，分別加入適量1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，后續(xù)按1.2.3樣品溶液處理方法進(jìn)行，制備含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素濃度分別為 0.002，0.02，2.0 μg/mL 的加標(biāo)溶液，再按1.3色譜和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述加標(biāo)溶液，每份加標(biāo)溶液制備5份，扣本底后計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表6。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣品，過200目篩網(wǎng)，去除肉眼可見異物，分別加入適量1.2.1孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再加0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，后續(xù)按1.2.3樣品溶液處理方法進(jìn)行，制備含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素濃度為0.01 μg/mL的重復(fù)性溶液，同法制備6份，再按1.3色譜和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述重復(fù)性溶液，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的RSD。結(jié)果，孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素重復(fù)性RSD均在5.0%以內(nèi)，結(jié)果表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

隨機(jī)在水產(chǎn)養(yǎng)殖廠采集水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣5份，置棕色容量瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，按1.2.3樣品溶液處理方式進(jìn)行，制備樣品溶液，每份樣品制備3份，再按1.3色譜和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算5份不同樣品中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素的含量。結(jié)果見表7。

表7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)以水產(chǎn)養(yǎng)殖水為研究對(duì)象，結(jié)合近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖特點(diǎn)，針對(duì)孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氧氟沙星、恩諾沙星和土霉素5種目標(biāo)物，建立了采用固相萃取法提取、凈化、洗脫水產(chǎn)養(yǎng)殖水中的上述5種目標(biāo)物，液相色譜-質(zhì)譜法定量、定性檢測(cè)的分析方法。對(duì)方法的前處理方法和固相萃取柱類型進(jìn)行了確定，考察了方法的線性等參數(shù)，并根據(jù)創(chuàng)建的方法對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水進(jìn)行了檢測(cè)應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，此方法檢出限低、操作步驟簡單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水中極微量殺菌劑、抗生素等殘留的檢測(cè)。