藜麥不同生長時(shí)期內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

譚佳淇，何小慧，趙江林，李麗嬌，涂文應(yīng)，鮑志杰，李 強(qiáng)

(成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106)

0 引 言

藜麥（Chenopodium quinoaWilld）原產(chǎn)于南美洲，是一種富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、礦物質(zhì)、維生素的高價(jià)值谷物[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）確認(rèn)藜麥?zhǔn)且环N可滿足人體全部營養(yǎng)需求的單體糧食作物，美國航天局（NASA）將藜麥列為理想“太空糧食”[2-5]。藜麥中的多酚、黃酮、皂苷等活性成分具有抗氧化、降血糖、消炎、抑菌、免疫等生物活性，對心血管疾病、肥胖、糖尿病等有很好的預(yù)防效果[2]。植物內(nèi)生菌是指生活史一定階段或全部階段生活于健康植物的組織或器官內(nèi)部的微生物，包括真菌、細(xì)菌和放線菌等[6]。植物內(nèi)生菌與植物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，形成了互利共生關(guān)系：宿主植物為內(nèi)生菌的生存繁殖提供了穩(wěn)定的生活環(huán)境，而內(nèi)生菌可增強(qiáng)宿主植物的抗病、抗旱和固氮等能力，也可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物的生長發(fā)育[7-8]。此外，植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物還具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、殺蟲、免疫抑制和降糖等活性[9]。

國內(nèi)引種藜麥的時(shí)間較短，關(guān)于藜麥內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性和次生代謝產(chǎn)物等還不夠了解。因此，解析藜麥內(nèi)生微生物的群落結(jié)構(gòu)，了解其內(nèi)生菌的優(yōu)勢種群，將為藜麥的栽培和分離篩選有益微生物打下基礎(chǔ)。目前，已有學(xué)者采用高通量測序技術(shù)揭示了連作藜麥土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化，但尚未見藜麥不同組織間內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的相關(guān)報(bào)道[10]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們可以直接獲取自然環(huán)境中微生物的遺傳信息，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進(jìn)行比對分析, 從而獲得不同物種的多樣性和豐度信息[11-12]。與傳統(tǒng)的第一代測序方法相比，16S rRNA高通量測序具有操作簡便，提供的遺傳信息豐富等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[13-16]。本試驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)，以藜麥作為研究對象，分析了藜麥不同生長時(shí)期、不同部位(根、莖、葉、籽粒)的微生物種群豐度和多樣性變化，對于藜麥的栽培提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

藜麥幼苗期和成熟期樣品2019年采集于成都大學(xué)栽培試驗(yàn)基地，分別采集3株藜麥幼苗和3株成熟藜麥的根、莖、葉，裝于無菌封口袋中，保存于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)分析。后文分別采用MR、MS、ML、 MSpike、YR、YS、YL 代表藜麥成熟期根部、成熟莖部、成熟期葉部、籽粒、幼苗期根部、幼苗期莖部和幼苗期葉部樣品編碼。

1.2 樣品前處理

根據(jù)劉金花[17]的方法將藜麥樣品葉切成 1 cm2，莖和根切成 1 cm 左右小段（兩端皆有切口）。然后將根、莖、葉、籽粒分別用 75% 酒精浸泡 1 min ，1%次氯酸鈉溶液（含游離氯>2.5%）浸泡10～15 min，75% 酒精再浸泡 1 min，之后用無菌水沖洗 5遍進(jìn)行表面消毒，并用最后一次淋洗的無菌水涂布到LB平板上30 ℃培養(yǎng)24 h檢測表面消毒效果。

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用 CTAB方法對樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA。以提取的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4 文庫構(gòu)建及上機(jī)測序

使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫庫檢合格后，使用Hiseq進(jìn)行上機(jī)測序。藜麥內(nèi)生菌樣本高通量測序委托北京諾禾致源生物公司完成。數(shù)據(jù)下機(jī)后分析藜麥內(nèi)生菌的α和 β多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀疏曲線分析

為探究檢測樣本α多樣性指數(shù)隨著測序深度的變化趨勢，以評價(jià)實(shí)驗(yàn)測序深度能否充分反映所測樣本的微生物多樣性情況，根據(jù)觀察到的物種數(shù)與測序條帶數(shù)繪制稀疏曲線如圖1所示。由圖可知所有樣本檢測到的物種數(shù)隨著測序條帶數(shù)增加至期的根部細(xì)菌Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于藜麥幼苗期（P< 0.05）；成熟期和幼苗期的藜麥根部細(xì)菌Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于成熟期和幼苗期的藜麥莖、葉細(xì)菌（P< 0.05）。圖2所示箱線圖則是不同樣本Alpha多樣性指數(shù)的直觀展示，各指數(shù)大小通過中位線高低判斷。由表1和圖2可知，整體上成熟期的根、莖、葉多樣性指數(shù)50000時(shí)，雖物種數(shù)目仍然有所增加，但整體曲線勢均趨于平緩，說明實(shí)驗(yàn)所測樣本能充分地反映真實(shí)情況下藜麥樣品絕大部分細(xì)菌的群落多樣性。

圖1 樣本稀疏曲線

圖2 多樣性指數(shù)分組箱線圖

表1 藜麥微生物多樣性指數(shù)表1)

2.2 藜麥樣品Alpha多樣性分析

對各藜麥樣品的微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，選取Chao1指數(shù)[18]，Shannon指數(shù)[19]和Simpson指數(shù)[20]來表征藜麥微生物群落的Alpha多樣性。如表1所示，指數(shù)數(shù)據(jù)越大，表明其相對微生物多樣性和豐富度越高。單因素方差分顯示，藜麥成熟相對幼苗期較大，說明藜麥成長過程中其內(nèi)生菌與藜麥在協(xié)同進(jìn)化過程中，其微生物多樣性會增加，導(dǎo)致成熟期微生物多樣性明顯高于幼苗期。對比不同部位多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，無論是成熟期還是幼苗期，均呈現(xiàn)根部遠(yuǎn)高于莖部，葉部最低的現(xiàn)象。呈現(xiàn)距離地面土壤越近，微生物多樣性指數(shù)越高的趨勢，推測可能藜麥生長過程中越靠近土壤內(nèi)生微生物越容易附著生長，而越靠近土壤，根系土壤中的部分微生物種群進(jìn)入到植物根部定植，導(dǎo)致微生物多樣性高。

2.3 藜麥群落結(jié)構(gòu)組成分析

如圖3所示，對藜麥樣品豐度前10的門進(jìn)行注釋，整體上看各樣本藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）占比最大，各樣本中豐度均超過60%，其次是變形菌門（Proteobactrtia）和放線菌門（Actinobacteria），這三類細(xì)菌是藜麥主要的內(nèi)生菌。對比不同位置豐度發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）呈現(xiàn)葉部>莖部>根部的趨勢，而變形菌門（Proteobactrtia）則呈現(xiàn)相反的葉部<莖部<根部的趨勢，而放線菌門（Actinobacteria）僅在根部含有且占據(jù)一定比例豐度，說明根莖葉主要內(nèi)生菌存在較大差異。而籽粒內(nèi)生菌情況則與莖部較為相似。對比成熟期和幼苗期相同位置的內(nèi)生菌情況發(fā)現(xiàn)，相同位置主要內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)大體相似，并未呈現(xiàn)明顯差異，但成熟期內(nèi)生菌種類明顯較幼苗期更為豐富，這與前文Alpha多樣性分析結(jié)論一致。綜上表明，不同位置群落結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)較為明顯的分化情況，且分化呈現(xiàn)一定規(guī)律，但成熟期和幼苗期的群落結(jié)構(gòu)除內(nèi)生菌種類明顯增加外并未出現(xiàn)明顯分化。

圖3 門水平群落結(jié)構(gòu)

如圖4所示，對藜麥樣品豐度前10的屬進(jìn)行注釋。整體上看成熟期其他種屬（others）的內(nèi)生細(xì)菌含量高于相同部位的幼苗期藜麥，表明幼苗期藜麥內(nèi)生菌的種群豐度較為集中。Cyanobacteria和Rickettsiales中的未知屬以及鏈霉菌屬（Streptomyces）是藜麥樣品中豐度最高的內(nèi)生菌，各樣本中豐度均超過60%。成熟期內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)與幼苗期并未出現(xiàn)明顯分化，Cyanobacteria中的未知屬呈現(xiàn)葉部>莖部>根部的趨勢，Rickettsiales中的未知屬呈現(xiàn)相反的葉部<莖部<根部的趨勢。

圖4 屬水平群落結(jié)構(gòu)

鏈霉菌屬(Streptomyces)和擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)是根部豐度較高的內(nèi)生菌種群。鏈霉菌屬(Streptomyces)和擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)廣泛分布在土壤中，是重要的產(chǎn)抗生素的細(xì)菌。Igarashi[21]等從韭菜中分離得到的鏈霉菌，其發(fā)酵后可產(chǎn)生生物堿類活性化合物6-Prenylindole，能有效控制尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysoorum)的生長。Pullen[22]等從衛(wèi)茅科植物中分離出西唐鏈霉菌(S. setonii)和桑氏鏈霉菌(S.sampsonii)，其產(chǎn)生的抗生素氯吡咯對耐藥細(xì)菌抗性明顯。McCormick[23]等于1956年從印度尼西亞土壤中篩選到的東方擬無枝酸菌（Amycolatopsis orientalis）的發(fā)酵液中分離得到萬古霉素，萬古霉素是臨床上極為重要的糖肽類抗生素[24]。結(jié)合前文分析中根部微生物豐富度明顯高于莖部和葉部。由此推測正是由于藜麥根部含有較高豐度的鏈霉菌屬(Streptomyces)和擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)等產(chǎn)抗生素的細(xì)菌，它們共同形成了保護(hù)藜麥內(nèi)部生態(tài)系統(tǒng)免受其他有害菌的微生態(tài)屏障，將大量不利于藜麥生長發(fā)育的微生物攔截在根部以下，從而保證了藜麥植株的莖葉內(nèi)生菌系統(tǒng)的穩(wěn)定，從而使得藜麥生長發(fā)育過程中免受致病菌等有害微生物的侵害。

物種豐度熱圖可以直觀地觀察菌群豐度差異，顏色越紅代表菌群豐度越大，顏色越藍(lán)代表菌群豐度越小。對藜麥樣本進(jìn)行屬水平熱圖分析（見圖5）發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬(Streptomyces)、擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)、立克次體目中未識別的屬(unidentified-Rickettsiales)、馬賽菌屬（Massilia）等各類內(nèi)生菌含量在根部相對較高，而在莖部和葉部含量小，則代表根部這些菌群的豐度高于莖部和葉部。對比發(fā)現(xiàn)，成熟期的根部氏菌屬（Bosea）、柄細(xì)菌屬（Caulobacter）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鞘氨醇盒菌屬 (Sphingopyxis）、德沃斯氏菌屬（Devosia） 等較幼苗期根部各類內(nèi)生菌含量更高，說明隨著藜麥的生長發(fā)育，這些種群內(nèi)生菌得到了富集。此外，根部鏈霉菌屬(Streptomyces)和擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis)在成熟期和幼苗期的根部均保持了較高水平豐度，表明其可能在藜麥根部發(fā)揮重要生理、生態(tài)作用。

圖5 屬水平物種豐度熱圖

用 UPGMA 算法以 Weighted Unifrac Distance為度量進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果如圖6所示。聚類結(jié)果與PCA和PCoA聚類結(jié)果一致，成熟期和幼苗期相同位置群聚類相近，整體上根部和根部以上（莖、葉、籽粒）聚分為2大類。進(jìn)一步細(xì)分根、莖、葉被分別聚為三類，符合前文不同部位之間分化差異較大的結(jié)論。其中籽粒與莖部聚為一類，說明籽粒內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)和莖部有較大相似性。

圖6 UPGMA聚類圖

3 結(jié)束語

內(nèi)生菌在寄主植物生長發(fā)育中扮演了重要的角色[25-28]，同時(shí)也會參與到寄主的生長代謝，生物合成和抑菌等生命活動中，對其寄主植株的生長發(fā)育和產(chǎn)品品質(zhì)有著重要影響，因此研究植物內(nèi)生菌對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著重要意義。藜麥?zhǔn)俏覈匾霓r(nóng)作物，但目前關(guān)于藜麥內(nèi)生菌的報(bào)道較為少見，本文對成熟期和幼苗期藜麥的根部、莖部、葉部以及籽粒進(jìn)行取樣，采用16 s高通量測序技術(shù)對其內(nèi)生菌進(jìn)行分析。并對分析了不同部位和不同生長時(shí)期之間藜麥內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，對其中關(guān)鍵內(nèi)生菌進(jìn)行了分析，主要結(jié)論如下：

藜麥成熟期的根部細(xì)菌Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于藜麥幼苗期（P<0.05）；成熟期和幼苗期的藜麥根部細(xì)菌Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于成熟期和幼苗期的藜麥莖、葉細(xì)菌（P<0.05）；藜麥不同位置內(nèi)生菌差異較大，不同時(shí)期內(nèi)生菌未出現(xiàn)明顯分化。根部內(nèi)生菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與莖部、葉部、籽粒存在較大差異，根部內(nèi)生菌的豐度、內(nèi)生菌種類均遠(yuǎn)高于莖部、葉部、籽粒部分，而莖部、葉部、籽粒之間則差異較小，籽粒內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)與莖部最為相似；對比不同位置豐度發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）呈現(xiàn)葉部>莖部>根部的趨勢，而變形菌門（Proteobactrtia）則呈現(xiàn)相反的葉部<莖部<根部的趨勢。無論是成熟期還是幼苗期藜麥莖部和葉部群落結(jié)構(gòu)均較為穩(wěn)定，由于藜麥根部含有較高豐度的鏈霉菌屬(Streptomyces)和擬無枝菌酸菌屬(Amycolatopsis) 等產(chǎn)抗生素的細(xì)菌，它們共同維持了藜麥植株的莖葉內(nèi)生菌系統(tǒng)的平衡，從而使得藜麥生長發(fā)育過程中擁有優(yōu)良的抗菌性和環(huán)境適應(yīng)性。