溶質(zhì)運載蛋白16A家族成員10（SLC16A10）對膠質(zhì)瘤干細胞增殖及自我更新能力的影響

李圓圓，黃浩浩，滿江紅

（1.國家生物醫(yī)學分析中心，北京 100850；2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430070）

多形性膠質(zhì)母細胞瘤是惡性程度最高的原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤，目前臨床上常規(guī)治療的方法為最大安全范圍手術(shù)切除聯(lián)合放療及藥物化療綜合治療，但治療效果仍不甚理想［1-4］，患者平均生存周期僅為15～18個月［5-6］。膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSC）是腫瘤組織中具有自我更新、多種系分化和腫瘤形成能力的一小群腫瘤細胞。越來越多的研究表明，GSC是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展和復發(fā)及放療和化療抵抗的重要原因［7-8］。

溶質(zhì)運載蛋白16A家族成員10（solute carrier family 16 member 10，SLC16A10）屬于SLC16A家族，該家族還包括其他13個成員，其中SLC16A1，SLC16A3，SLC16A7和SLC16A8編碼單羧酸轉(zhuǎn)運體，催化乳酸、丙酮酸和酮體等單羧酸的轉(zhuǎn)運；SLC16A2編碼高親和性甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體8；其他8個的底物和作用機制尚不清楚［9］。SLC16A10在體內(nèi)分布廣泛，包括小腸、腎、肝和骨骼等［10-12］，所編碼的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白能夠以不依賴Na+的方式輸運芳香氨基酸，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，參與細胞的攝取和排出［13-14］及細胞代謝［4，15-16］，對腸道和腎等所產(chǎn)生的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運有重要作用［11］。然而，目前尚無關(guān)于SLC16A10芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白對GSC功能影響的研究報道，其作用機制亦不清楚。

本研究室前期通過對387GSC，4121GSC，H2S和456GSC 4株GSC及其分化后的非干性腫瘤細胞（non-stem tumor cells，NSTC）表達的差異蛋白進行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)SLC16A10在387GSC中高表達。本研究通過檢測387GSC細胞活力和腫瘤細胞球形成能力，觀察SLC16A10對387GSC增殖及自我更新能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人胚胎腎293T細胞購自中國科學院細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM完全培養(yǎng)基中，置37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；人膠質(zhì)母細胞瘤干細胞387GSC，受贈于美國克利夫蘭醫(yī)學中心Cleveland Clinic，Jeremy Rich實驗室，并經(jīng)本研究室進行分離與功能鑒定［1］，在干細胞完全培養(yǎng)基中于37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；E.coli-DH5α感受態(tài)細胞（BC102-02），北京博邁德基因技術(shù)有限公司。FBS，中國依賽科（ExCell Bio）生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗混合液、胰蛋白酶、丙酮酸鈉、谷氨酰胺和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒（MaxiCaP），中科邁晨（北京）科技有限公司；Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基和B-27血清替代物，美國Thermo Fisher Scientific公司；堿性成纖維細胞生長因子和上皮生長因子，美國R&D Systems公司；5×慢病毒濃縮液，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司（Genstar）；Prime Script RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司；實時熒光定量PCR預混液（Power Up SYBR Green Master Mix）試劑盒，美國Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒和細胞活力檢測試劑盒（CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay），美國Promega公司；RNA提取試劑盒（RNeasy Mini Kit），德國Qiagen公司；兔抗人SLC16A10多克隆抗體（一抗），英國Abcam公司；小鼠抗人性別決定區(qū)Y框蛋白2（sex-determining region Y-box 2，SOX2）單抗隆抗體（一抗），美國Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor 488（綠色熒光）標記驢抗兔IgG抗體（二抗）、Alexa Fluor 546（紅色熒光）標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）和Hoechst 33342細胞核染料，美國Thermo Fisher Scientific公司；GAPDH抗體，實驗室自制。低溫高速離心機（型號5424R）和常溫高速離心機（型號5424），德國Eppendorf公司；Glomax 96微孔板發(fā)光檢測儀（型號9101-002），美國Promega公司；電泳儀（Basicpower），美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀（型號LC96），美國Roche公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

DMEM完全培養(yǎng)基配制：于DMEM培養(yǎng)基500 mL中加FBS 50 mL和青霉素-鏈霉素雙抗混合液5.5 mL，搖勻置冰箱4℃保存。

干細胞完全培養(yǎng)基配制：向500 mL Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加青霉素-鏈霉素雙抗混合液、丙酮酸鈉和谷氨酰胺各5.3 mL，隨后加B-27血清替代物10 mL以及終濃度為10 μg·L-1的堿性成纖維細胞生長因子和上皮生長因子，搖勻于冰箱4℃保存。

387NSTC分化：按血清誘導干細胞分化的方法［1］，將消化處理后的387GSC進行細胞計數(shù)；取2×106細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，加入DMEM完全培養(yǎng)基10 mL培養(yǎng)7 d后，收取分化后的387NSTC。

1.3 RT-qPCR檢測387GSC和387NSTC相關(guān)基因表達

用RNA提取試劑盒提取387GSC和387NSTC總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，配制體系為 RNA 500 ng，5×PrimeScript Mix 2 μL，DEPC水補充至10 μL；參照實時熒光定量PCR預混液使用說明進行熒光定量PCR。RT-qPCR所用引物均由PrimerBank網(wǎng)站設計，引物序列見表1，由生工生物科技有限公司合成。反應結(jié)束后，用LightCycler?96sw1.1軟件分析擴增曲線和熔解曲線，獲得目的基因和對照基因Ct值，用 2-ΔΔCt法計算SLC16A10，SOX2，Olig2和GFAP基因mRNA相對表達水平。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.4 shSLC16A10干涉質(zhì)粒載體構(gòu)建和慢病毒包裝

載體質(zhì)粒構(gòu)建：利用Sigma網(wǎng)站設計SLC16A10基因的小發(fā)夾（small hairpin RNA，shRNA）引物序列，選擇2對敲低效率最高的引物（分別命名為shSLC16A10#1和shSLC1610#2）分別由生工生物工程股份有限公司合成；非靶向發(fā)夾結(jié)構(gòu)（sh-non-target，shNT）的序列咨詢擎科生物科技有限公司獲得并合成引物序列見表2。將shNT和2對shRNA引物退火后分別連接于pLKO.1質(zhì)粒載體，構(gòu)建含shNT，shSLC16A10#1和shSLC16A10#2干涉序列載體的質(zhì)粒。

Tab.2 Primer sequences for small hairpin RNA（shRNA）

慢病毒包裝：將293T細胞消化處理為單個細胞并計數(shù)，取3×106細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，待細胞融合度約達60%，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒并根據(jù)使用說明進行慢病毒包裝。包裝質(zhì)粒psPAX2和pCMV-VSVG及目的質(zhì)粒（shNT，shSLC16A10#1或shSLC16A10#2）各5 μg加入1 mL HBS（平衡鹽溶液）混勻，靜置5 min；取70 μL CaCl2緩慢滴入混合液中，緩慢混勻，靜置15 min；將轉(zhuǎn)染體系滴加到細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染5 h后更換新的DMEM完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)72 h后收集培養(yǎng)基上清，600×g離心3 min，取上清用0.45 μm過濾器過濾；過濾后的液體中加入適當體積5×PEG病毒濃縮液混勻，4℃過夜；低溫離心機7000×g離心15 min后棄上清，將病毒沉淀用1 mL冰PBS重懸、分裝，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 慢病毒感染細胞

取1.5×106387GSC接種于10 cm培養(yǎng)皿中，分為shNT對照組、靶點1干涉（shSLC16A10#1）組和靶點2干涉（shSLC16A10#2）組，每皿加PBS病毒重懸液250 μL感染，加入10 mL DMEM完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后加入嘌呤霉素（終濃度2 mg·L-1）進行篩選，篩選2 d后收取慢病毒感染的細胞。

1.6 Western印跡法檢測SLC16A10敲低效果

將收取的慢病毒感染的細胞加入M2細胞裂解液（每1×106細胞，加100 μL），100 μL，重懸細胞，冰上裂解30 min后4℃，15 000×g離心15 min，取上清，用Bradford法進行蛋白質(zhì)定量。取40 μg總蛋白在5%濃縮膠和10%分離膠中電泳后，轉(zhuǎn)膜2 h。用5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗〔抗SLC16A10（1∶1000），抗GAPDH（1∶5000）〕4℃搖床孵育過夜；加二抗室溫搖床孵育1 h，用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒顯色，在暗室進行曝光顯影，用Image J軟件進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，以SLC16A10蛋白和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶IA比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.7 SLC16A10敲低后387GSC相對細胞活力和腫瘤細胞球形成數(shù)目測定

分別將shNT慢病毒感染對照組shSLC16A10#1和shSLC16A10#2組387GSC消化處理為單個細胞，計數(shù)，接種于96孔板，每孔2×103細胞，每組5復孔，各接種4個96孔板。在接種至孔板后分別于培養(yǎng)第0，2，4和6天用CellTiter-Glo試劑盒檢測387GSC相對細胞活力。

在培養(yǎng)第4天同時觀察各組孔板中細胞生長形態(tài)，并用成像顯微鏡拍照，統(tǒng)計每組腫瘤細胞球數(shù)目。

1.8 細胞免疫熒光檢測SLC16A10細胞定位

將免疫熒光專用小玻片（platinum line cover glass玻片）置于24孔板內(nèi)，并加入Metrigel膠300 μL 置 37℃培養(yǎng)箱 30 min，每孔接種 1×105387GSC，培養(yǎng)過夜。用預熱的4%多聚甲醛固定15 min，在含0.3%Triton X-100的1×PBS中打孔1 h，加入1%BSA封閉液37℃封閉1 h，加一抗〔抗SLC16A10和抗SOX2（1∶100）〕4℃孵育過夜，加二抗（1∶400）室溫孵育1 h，Hoechst 33342（1∶1000）溶于PBS中染核8 min，PBS清洗3次，封片劑封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色，并采集圖像，分析SOX2蛋白表達及SLC16A10和SOX2細胞定位。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 SLC16A10在GSC中高表達

如圖1所示，與387GSC相比，387NSTC中SLC16A10mRNA表達明顯減弱（P＜0.01），表明SLC16A10在387GSC中高表達；同時腫瘤干細胞標志物SOX2和Olig2mRNA表達顯著降低（P＜0.01），非干細胞標志物GFAP表達顯著升高（P＜0.01），表明387GSC分化為387NSTC。

Fig.1 Expressions of SLC16A10,SOX2,Olig2 and GFAP mRNA in 387 glioma stem cells（387GSCs）and 387 non-stem tumor cells（387NSTCs）detected by RT-qPCR.Differentiation of 387GSCs was induced by exposure to DMEM with 10% fetal bovine serum for 7 d.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 387GSC group.

2.2 387GSC中SLC16A10敲低效果

Western印跡法結(jié)果（圖2）所示，與shNT對照組相比，shSLC16A10#1和shSLC16A10#2組387GSC SLC16A10表達均顯著下降（P＜0.01），表明2個靶點干涉效果明顯，可用于功能實驗。

Fig.2 Efficiency of knock down SLC16A10 in 387GSCs by Westren blotting.The 387GSCs were treated with PBS virus resuspension for 48 h and screening 48 h with puromycin 2 mg·L-1.IA：integrated absorbance.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01,compared with shNT group.

2.3 敲低SLC16A10抑制387GSC增殖

如圖3所示，shNT對照組387GSC相對細胞活力隨時間延長現(xiàn)明顯升高（P＜0.01）；與shNT對照組比較，shSLC16A10#1和shSLC16A10#2組387GSC相對細胞活力均下降（P＜0.01），表明敲低SLC16A10可明顯抑制387GSC增殖。

Fig.3 Effect of SLC16A10 knock down on cell viability of 387GSCs detected by CellTiter-Glo kit.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with shNT control group.

2.4 敲低SLC16A10抑制387GSC自我更新

如圖4所示，387GSC在體外培養(yǎng)時懸浮生長，易形成腫瘤細胞球。敲低SLC16A10組腫瘤細胞球數(shù)量較shNT對照組明顯減少（P＜0.01），表明敲低SLC16A10后，387GSC腫瘤細胞球的形成能力顯著降低。

Fig.4 Effect of SLC16A10 knock down on cell self-renewal of 387GSCs.A was microscopic imaging result of sphere state of cells on the 4thday.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with shNT control group.

2.5 SLC16A10在387GSC中細胞定位

如圖5所示，紅色熒光指示SOX2蛋白表達，綠色熒光指示SLC16A10蛋白定位，藍色熒光指示細胞核。結(jié)果提示，SOX2作為干細胞標志物在多數(shù)387GSC中表達，且SOX2主要定位于細胞核，SLC16A10蛋白不定位于GSC細胞核。

Fig.5 Cell localization of SLC16A10 in 387GSCs by immunofluorescence assay.Immunofluro rescence images of 387GSCs with SLC16A10 antibody and SOX2 antibody.Nuclei were labelled with Hoechst 33342.

3 討論

本研究結(jié)果表明，SLC16A10在387GSC中的表達水平顯著高于387NSTC，提示SLC16A10在GSC中高表達，在GSC生長、增殖、遷移、侵襲以及抵抗放化療中可能發(fā)揮特殊功能。SOX2和Olig2是腫瘤干細胞標志物，GFAP是非干性腫瘤細胞標志物，可共同指示387GSC分化為387NSTC后細胞干性丟失。研究結(jié)果表明，分化7 d后，387NSTC內(nèi)SOX2和Olig2mRNA表達顯著下降，GFAPmRNA表達升高，表明387NSTC已分化完成。

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染體系干涉GSC中SLC16A10的表達。結(jié)果表明，靶向SLC16A10mRNA的2個不同shRNA序列的慢病毒均可明顯抑制387GSC中SLC16A10的表達。同時，敲低SLC16A10的387GSC相對細胞活力和細胞球形成均受到顯著抑制。細胞球形成數(shù)目反映387GSC自我更新能力。由此表明，SLC16A10在387GSC增殖和自我更新過程中發(fā)揮重要功能，是一種潛在膠質(zhì)瘤的治療靶點。

本研究通過免疫熒光實驗檢測SLC16A10蛋白在387GSC中的細胞定位，實驗結(jié)果初步排除了SLC16A10蛋白定位于細胞核的可能性。SLC16A10蛋白的細胞膜或細胞質(zhì)定位需進一步實驗研究。

芳香族氨基酸的非正常代謝是多種疾病的致病因素［17］，高含量的芳香族氨基酸也可作為診斷多種癌癥的潛在的生物標志物［18］。SLC16A10作為一種重要的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運體，在387GSC中特異性高表達，這是否與腦膠質(zhì)瘤中芳香族氨基酸代謝有關(guān)，尚有待進一步研究。

綜上，本研究結(jié)果表明，SLC16A10是一種有潛力的膠質(zhì)瘤治療靶點或診斷標志物。關(guān)于敲低SLC16A10抑制387GSC增殖及自我更新能力的具體機制尚待進一步研究。