內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J 成員11 mRNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值

王芳，周開甲，趙征，梁暉，劉彥偉

0 引言

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤[1]。近年來(lái)，研究闡明了膠質(zhì)瘤的一些遺傳變化，如IDH1/2[2]和TP53[3]及ATRX[4]突變、tert啟動(dòng)子突變[5]、MET擴(kuò)增[6]、MGMT啟動(dòng)子甲基化[7]和1p/19q共缺失[8]，有助于指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的分類和治療。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2016年結(jié)合分子標(biāo)志物IDH及1p19q對(duì)其進(jìn)行了分子分類[9]。但是高級(jí)別膠質(zhì)瘤預(yù)后不良，尤其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者5年生存率僅為5%[1,10]，目前利用高通量技術(shù)尋找、篩查對(duì)臨床診斷及預(yù)后判斷有價(jià)值的分子指標(biāo)，并據(jù)此對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行分子分類，進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)靶向藥物研發(fā)成為研究熱點(diǎn)[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn)，跨細(xì)胞膜的離子通量的變化對(duì)于維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。離子通道的失調(diào)和（或）功能異常是包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵事件。包括電壓門控、瞬時(shí)受體電位通道以及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在內(nèi)的離子通道在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮相關(guān)作用，可能是進(jìn)行臨床干預(yù)的新標(biāo)志物和靶點(diǎn)[13–15]。由內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J成員11（inward rectifier potassium channel subfamily J member 11,KCNJ11）編碼的Kir6.2和ATP結(jié)合盒亞家族C成員8（ATP binding cassette subfamily C member 8,ABCC8）編碼的SUR1組成的ATP敏感度鉀通道（KATP）對(duì)血糖濃度與胰島素分泌的耦合起關(guān)鍵作用。ABCC8或KCNJ11突變引起通道功能下降會(huì)導(dǎo)致先天性高胰島素血癥[16]，高胰島素血癥可促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生[17]。而KCNJ11突變引起的通道功能增加可導(dǎo)致新生兒糖尿病[18]，KCNJ11突變糖尿病患兒常合并有發(fā)育延遲、癲癇、認(rèn)知功能下降神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[19]。先前研究發(fā)現(xiàn)，ABCC8 mRNA表達(dá)可以預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后及對(duì)替莫唑胺的敏感度[20]，但KCNJ11在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用價(jià)值未見報(bào)道。在此，我們研究了273例不同腦膠質(zhì)瘤患者的KCNJ11 mRNA表達(dá)，探討其作預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃（CGGA）中收集273例不同腦膠質(zhì)瘤患者的臨床信息（性別、年齡、復(fù)發(fā)與否、術(shù)后放化療）、病理信息（組織病理類型、WHO分級(jí)、IDH突變、1p/19q缺失、MGMT甲基化）及隨訪信息（生存期）。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患者進(jìn)行分子分級(jí)。從最初病理診斷到死亡或最后一次隨訪日期，計(jì)算臨床終點(diǎn)事件的總生存率。本研究獲得北京天壇醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KYSB 2015-017），所有患者均簽署了書面知情同意書。

1.2 研究方法

從CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cgga.org.cn/download.jsp）中下載入選的273例不同腦膠質(zhì)瘤患者的KCNJ11 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。所有入選患者病變組織均經(jīng)病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤。數(shù)據(jù)庫(kù)中通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲取KCNJ11 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)方法均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行。RNAseq文庫(kù)的制備、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析與本研究組之前的研究[21]一樣。使用安捷倫2100生物分析儀檢查總RNA的完整性。僅使用RNA完整性值（RIN）≥6.8的優(yōu)質(zhì)樣本構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。使用2100生物分析儀測(cè)量DNA片段的長(zhǎng)度，然后使用Illumina HiSeq 2000/2500/4000測(cè)序系統(tǒng)對(duì)RNA序列庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。閱讀長(zhǎng)度分別為101、125或150 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件、R 3.3.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和盒式散點(diǎn)圖及生存曲線繪制。采用卡方檢驗(yàn)比較不同臨床及病理特征的腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA表達(dá)。對(duì)符合正態(tài)分布的KCNJ11 mRNA表達(dá)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析及LSD-t兩兩比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。對(duì)不同組別腦膠質(zhì)瘤患者生存期采用Kaplan-Meier曲線及Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者的生存影響因素采用單因素及多因素Cox回歸分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料、病理特征及KCNJ11 mRNA表達(dá)

根據(jù)入選的273例腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA中位表達(dá)值（2.77）分類，≥2.77為高表達(dá)、＜2.77為低表達(dá)。KCNJ11 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者年齡、是否復(fù)發(fā)、組織病理類型、WHO分級(jí)、IDH突變狀態(tài)、1p/19q 共缺失狀態(tài)、MGMT甲基化狀態(tài)、術(shù)后有無(wú)接受化療及WHO 2016年分子分級(jí)顯著相關(guān)（P＜0.05），見表1。

2.2 不同臨床及組織病理特征腦膠質(zhì)瘤患者的KCNJ11 mRNA表達(dá)比較

在預(yù)后較好的腦膠質(zhì)瘤患者，如：年輕患者（P=0.008)、原發(fā)膠質(zhì)瘤（P=0.001）、MGMT甲基化膠質(zhì)瘤（P=0.036）患者中KCNJ11 mRNA表達(dá)較高。病理類型中KCNJ11 mRNA在少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中表達(dá)最高，星形細(xì)胞瘤患者次之，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中最低（P=0.000）。在WHO分級(jí)中KCNJ11 mRNA在Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中表達(dá)最高，Ⅲ級(jí)次之，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者中最低（P=0.000），見圖1。

圖1 不同臨床及組織病理特征腦膠質(zhì)瘤患者的KCNJ11 mRNA表達(dá)Figure 1 Expression of KCNJ11 mRNA in glioma patients with different clinical and histopathological characteristics

2.3 不同分子病理特征腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA表達(dá)比較

IDH突變型腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA表達(dá)高于IDH野生型患者（P=0.000）；根據(jù)WHO分級(jí)分層后，各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者中仍出現(xiàn)同樣的結(jié)果，見圖2A、B。1p/19q聯(lián)合缺失腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA表達(dá)高于無(wú)聯(lián)合缺失患者（P=0.000）；根據(jù)WHO分級(jí)分層后，各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者中仍出現(xiàn)同樣的結(jié)果，見圖2C、D。IDH突變、1p/19q缺失型較低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅡ～Ⅲ）KCNJ11 mRNA表達(dá)高于IDH突變、1p/19q無(wú)缺失型較低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅡ～Ⅲ）和IDH野生型較低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅡ～Ⅲ）（P=0.000），見圖2E。

圖2 不同分子病理特征腦膠質(zhì)瘤患者的KCNJ11 mRNA表達(dá)Figure 2 Expression of KCNJ11 mRNA in glioma patients with different molecular pathological characteristics

2.4 腦膠質(zhì)瘤患者KCNJ11 mRNA表達(dá)與生存期的關(guān)系

結(jié)果表明，KCNJ11 mRNA高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤患者比低表達(dá)患者生存期更長(zhǎng)（χ2=92.891,P=0.0 0 0）。進(jìn)一步亞組分析顯示在低級(jí)別（χ2=5.313,P=0.021）和高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者（χ2=29.456,P=0.000）中，KCNJ11 mRNA高表達(dá)患者較低表達(dá)患者均有更長(zhǎng)的生存期，見圖3。

圖3 不同分級(jí)的KCNJ11 mRNA高、低表達(dá)組腦膠質(zhì)瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線Figure 3 Kaplan-Meier survival curves of patients with glioma in high and low KCNJ11 mRNA expression groups

2.5 影響腦膠質(zhì)瘤患者生存期因素的單因素及多因素Cox回歸分析

單因素Cox分析顯示年齡、是否復(fù)發(fā)、組織病理、WHO分級(jí)、IDH突變狀態(tài)、1p/19q共缺失狀態(tài)、術(shù)后放療、術(shù)后化療和KCNJ11 mRNA表達(dá)是影響患者生存期的因素（均P＜0.05）。多因素Cox分析顯示KCNJ11 mRNA高表達(dá)、1p/19q共缺失和術(shù)后化療是良好生存期的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05,均HR＜1），而年齡、復(fù)發(fā)和WHO分級(jí)是不良生存期的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05,均HR＞1），見表2。

表2 影響腦膠質(zhì)瘤患者生存期的單因素、多因素Cox回歸分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analyses of survival of glioma patients

3 討論

KCNJ11基因編碼三磷酸腺苷敏感度鉀通道的Kir6.2亞基。KATP通道是獨(dú)特進(jìn)化的蛋白質(zhì)復(fù)合物，先后在心肌、胰腺β細(xì)胞、腦、骨骼肌和血管平滑肌中被發(fā)現(xiàn)。通過將細(xì)胞腺嘌呤核苷酸濃度與膜電位耦合，起“代謝傳感器”的作用，可將細(xì)胞能量水平與細(xì)胞興奮性耦合，將代謝狀態(tài)轉(zhuǎn)化為電活動(dòng)，控制著廣泛的生理過程，包括激素分泌、神經(jīng)元傳遞、血管擴(kuò)張以及針對(duì)缺血性損傷的心臟和神經(jīng)元預(yù)處理[22]，以適應(yīng)不斷變化的代謝環(huán)境。分子克隆和功能表征揭示由內(nèi)向整流鉀通道（Kir）和磺酰脲受體（SUR）兩種蛋白共同組成該通道，屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族[23]。Kir可分為Kir6.1和Kir6.2，SUR可分為SUR1和SUR2，SUR2又可分為SUR2A及SUR2B。不同組織中的KATP通道由于Kir6.1或Kir6.2與SUR1或SUR2的不同組合，具有不同的功能和藥理學(xué)特性。Kir6.2/SUR1主要表達(dá)于胰腺內(nèi)分泌胰島和大腦，Kir6.2/SUR2A主要表達(dá)心肌細(xì)胞和骨骼肌，Kir6.1/SUR2B主要表達(dá)于血管平滑肌。SUR1由ABCC8基因編碼，ABCC8和KCNJ11基因突變與一系列胰島素分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：KCNJ11 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)，惡性程度越高，表達(dá)越低；低表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、WHOⅢ～Ⅳ級(jí)、高分子分級(jí)膠質(zhì)瘤、IDH野生型及1p19q無(wú)缺失型膠質(zhì)瘤患者，提示其可以用于預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤的惡性程度。同時(shí)KCNJ11 mRNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的生存期有關(guān)，表達(dá)越低，生存期越短，提示其可以用于預(yù)測(cè)患者的生存預(yù)后。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)：KCNJ11 mRNA表達(dá)是影響腦膠質(zhì)瘤患者生存期的獨(dú)立影響因素，可以作為預(yù)后指標(biāo)預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者生存期。類似的研究目前未見報(bào)道。

KCNJ11 mRNA在惡性腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低及低表達(dá)引起短生存期的具體機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)：幾種離子通道的表達(dá)受激素、化學(xué)致癌物或人乳頭瘤病毒癌基因等腫瘤相關(guān)因素的調(diào)節(jié)[24-26]。Sato等[27]研究發(fā)現(xiàn)：中度缺氧誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞凋亡，使胰島中KCNJ11表達(dá)下調(diào)，揭示低氧是胰腺β細(xì)胞的新型應(yīng)激源，并且低氧應(yīng)激導(dǎo)致β細(xì)胞功能惡化。由此推測(cè)，隨著惡性程度的增加，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞密度增加，內(nèi)部壞死，腫瘤細(xì)胞處于饑餓缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致KCNJ11表達(dá)下調(diào)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，真核RNA G-四鏈體富含mRNA 3'-UTR，保證了KCNJ11 mRNA的正常表達(dá)。而microRNA通過結(jié)合mRNA 3'-UTR，破壞了心肌細(xì)胞中的RNA G-四鏈體穩(wěn)定性，抑制了KCNJ11表達(dá)。

KCNJ11編碼胰腺ATP敏感鉀通道（KATP）的Kir6.2亞單位。該通道有兩個(gè)重要的亞基：成孔的Kir6.2亞基和磺酰脲受體1調(diào)節(jié)亞基。KCNJ11 mRNA在β細(xì)胞和神經(jīng)元中的表達(dá)升高。通道開放引起的KATP電流增加導(dǎo)致β細(xì)胞膜超極化，從而抑制胰島素分泌。相反，在葡萄糖增加時(shí)關(guān)閉這一通道會(huì)觸發(fā)胰島素從β細(xì)胞釋放到血液中，從而有助于控制血糖水平。在神經(jīng)元中，KATP電流增加會(huì)導(dǎo)致電活動(dòng)減少。KCNJ11突變與兩種主要表型有關(guān)：中度發(fā)育遲緩和（或）肌肉無(wú)力但不伴有癲癇的新生兒糖尿病和發(fā)育遲緩、癲癇的新生兒糖尿病。本研究發(fā)現(xiàn)，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中，KCNJ11 mRNA表達(dá)上調(diào)，而少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者常合并癲癇發(fā)作，兩者之間是否存在一定的聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。

Griscelli等[29]提取KCNJ11突變的糖尿病患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，通過非整合型病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)重新編程的KCNJ11突變細(xì)胞具有正常的核型，而KCNJ11突變細(xì)胞具有表達(dá)多能性標(biāo)志，并具有向三個(gè)胚層的分化能力。由此提示，在KCNJ11低表達(dá)的膠質(zhì)瘤中，是否具有更多的幼稚干細(xì)胞，導(dǎo)致其增殖能力及惡性度更高，預(yù)后更差，有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤惡性程度越高，KCNJ11 mRNA表達(dá)越低。KCNJ11 mRNA高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者良好預(yù)后的獨(dú)立影響因素。但腦膠質(zhì)瘤患者中KCNJ11 mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白翻譯水平調(diào)控作用機(jī)制及針對(duì)該靶點(diǎn)的靶向藥物研發(fā)等相關(guān)研究較少，值得進(jìn)一步研究跟挖掘。