四川省不同產(chǎn)區(qū)中川芎藥材質(zhì)量評價研究

童菊華，鄢章龍，吳經(jīng)耀，劉志華，馮 瑛

(1.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州310023；2.江西藥都樟樹制藥有限公司，江西 宜春 331200)

川芎為臨床常用中藥材，來源于傘形科植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根莖，為活血行氣之要藥[1]。川芎所含多種化學成分，主要包括內(nèi)酯類、有機酸和酚類化合物[2]。大量的研究表明，川芎對心腦血管、呼吸、泌尿系統(tǒng)及婦科的疾病有一定的治療效果[3]。

隨著2017年《中華人民共和國中醫(yī)藥法》的頒布和一系列政策的出臺，中藥配方顆粒、經(jīng)典名方的開發(fā)已成為當前中醫(yī)藥研究的熱點之一。而中藥材是中藥制劑研發(fā)和生產(chǎn)的源頭，其產(chǎn)地是影響中藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，固定產(chǎn)地是保證中藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定的重要方法。

中藥材及飲片質(zhì)量評價的研究較為成熟，主要有一測多評法、指紋圖譜相似度評價等方法[4-6]，大多是通過測定樣品中有效成分的含量以及共有的特征峰進行評價，對藥材中其他可能影響藥材質(zhì)量的因素研究較少。本研究為客觀有效地表征道地產(chǎn)區(qū)的川芎藥材質(zhì)量，保證原藥材有效性和安全性，根據(jù)2015年版《中國藥典》對川芎的檢測項目，對阿魏酸的含量測定方法進行了優(yōu)化，同時對21批川芎藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物等常規(guī)理化項目進行評價，主要通過SIMCA分析軟件對所得的5個指標性數(shù)據(jù)進行降維處理，并進行主成分分析，以期為四川道地產(chǎn)區(qū)川芎藥材質(zhì)量控制和種質(zhì)資源的優(yōu)選提供理論和實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫公司)；ME204-E電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，純度99.0%)，乙腈為色譜純(默克)；甲醇為分析純；水為超純水，21批川芎藥材來源見表1。

表1 川芎藥材來源

2 方法

2.1 色譜條件

按照2015年版《中國藥典》的方法對阿魏酸以及川芎樣品進行分析，色譜條件為：色譜柱為Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-1%醋酸水(30∶70)等度洗脫，柱溫30 ℃，流速1.00 mL·min-1，檢測波長321 nm，進樣量10μL。優(yōu)化后的色譜條件為：色譜柱為Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(17∶83)等度洗脫，柱溫30 ℃，流速1.00 mL·min-1，檢測波長321 nm，進樣量10μL，理論塔板數(shù)按阿魏酸計算不少于4 000。色譜見圖1。結(jié)果表明改用乙腈-0.1%磷酸水溶液后，阿魏酸保留時間為11 min，而藥典方法中阿魏酸的保留時間為20 min左右，極大地縮短了分析時間，節(jié)約溶劑，提高效率。

注：A 對照品溶液；B.供試品溶液；1.阿魏酸(藥典方法)；C.對照品溶液；D.供試品溶液(優(yōu)化后)。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制 精密稱取阿魏酸對照品10.59 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸的貯備液，再精密量取1 mL至10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品S1粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45μm濾膜，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備 分別精密量取“2.2.1”項下對照品的貯備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL至10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得S1～S7對照品溶液。分別按“2.1”項下的色譜條件分析，測定峰面積，以峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行線性回歸。結(jié)果表明，阿魏酸0.083 9～0.335 5μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=6 022.992 0X-17.338 6，R2=0.999 9。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，在“2.1”項下優(yōu)化后的色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，測得阿魏酸峰面積RSD為0.1%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取S1樣品粉末，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算阿魏酸的含量，阿魏酸含量的RSD為0.8%。結(jié)果表明，本法具有良好的重復性。

2.3.4 加樣回收率試驗 取已知含量的S1粉末 0.25 g(阿魏酸含量為1.1 mg·g-1)共 6 份，精密稱定。加入2.5 mL“2.2.1”項下對照品貯備液，按“2.2.2”項下方法制備，依法測定，計算阿魏酸的平均回收率為 98.7%，RSD為0.8%，表明方法的回收率良好，結(jié)果見表2。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取S1樣品按“2.1”項下色譜條件進樣，分別于0，3，6，9，12，24，36 h測定，記錄阿魏酸的峰面積。其峰面積的RSD為0.7(n=6)。結(jié)果表明36 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.6 川芎藥材含量測定 取21批川芎藥材粉末，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定。川芎樣品中阿魏酸的含量結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.7 川芎藥材水分、浸出物、總灰分以及酸不溶性灰分的測定 按2015年版《中國藥典》一部川芎質(zhì)量標準項下的要求分別對21批川芎藥材樣品進行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果 (%)

2.3.8 統(tǒng)計學分析 以不同產(chǎn)區(qū)川芎藥材阿魏酸的峰面積為原始數(shù)據(jù)，運用SPSS 19.0 軟件進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)結(jié)，結(jié)果見圖2。同時對阿魏酸的含量、水分、浸出物、總灰分及酸不溶性灰分等5個指標進行主成分分析，利用模式識別對數(shù)據(jù)降維處理，得到主成分的得分圖和載荷圖，結(jié)果見圖3。

圖2 川芎樣品聚類分析樹狀圖

3 結(jié)果

由聚類分析圖可知(圖2)，當組間距為15時，川芎藥材被分為3類，S3為Ⅰ類；S2，S9，S10，S15，S19，S20為Ⅱ類；其他為Ⅲ類。以阿魏酸的含量為評價標準，S3(四川夾江)質(zhì)量最優(yōu)。由主成分得分圖(圖3a)可知[R2X(cum)=1；Q2(cum)=0.936]，說明此模型可靠性高；圖3b表示各個主成分對模型分類的相關(guān)性，水分對模型分類呈負相關(guān)，阿魏酸的含量、醇溶性浸出物、總灰分及酸不溶性灰分呈正相關(guān)；圖3c為得分圖對應的載荷圖，反映了變量對樣品分類的貢獻程度，由圖3可知，浸出物對樣品分類的貢獻程度最高，水分次之，含量的貢獻程度較低，說明21批川芎藥材阿魏酸的含量差異不明顯。

圖3 川芎樣品主成分分析

4 結(jié)論

4.1 色譜條件的選擇

本實驗分別考察了甲醇-水、乙腈-0.085%磷酸水溶液與乙腈-0.1%磷酸水溶液，結(jié)果顯示以上3種流動相均能達到較好的分離，考慮分析時間及溶液配制的簡便性，最后選擇乙腈-0.1%磷酸。同時考察了不同品牌的色譜柱，結(jié)果顯示阿魏酸對色譜柱的耐用性較好，均能達到基線分離。

4.2 分析方法評價

本研究運用HPLC測定了21批阿魏酸的含量，說明該液相方法可靠、靈敏，與超高效液相相比，成本較低，儀器維護簡單。從聚類分析圖與主成分分析圖可知，僅用阿魏酸的含量作為分類依據(jù)與用多指標作為分類依據(jù)，對藥材質(zhì)量產(chǎn)地的劃分有一定的區(qū)別。因此，同時運用CA和PCA分析，兩者相互驗證和補充，可為川芎藥材質(zhì)量評價提供參考。從主成分得分圖可看出，同一產(chǎn)地的川芎分散到不同的區(qū)域，說明，川芎藥材的質(zhì)量可能與天氣溫濕度、采挖粗加工方式以及曬干溫度等因素相關(guān)。后續(xù)可收集更多產(chǎn)地川芎藥材進行篩選，找出質(zhì)量最優(yōu)產(chǎn)地。而主成分分析可篩選出共有的特征成分，得到?jīng)Q定因素，為川芎藥材質(zhì)量評價提供更多參考依據(jù)，進而從源頭保證中藥材的質(zhì)量。