全真一氣湯通過ACTA2調(diào)節(jié)COPD大鼠肺動脈平滑肌細胞收縮功能

蔡志勝，王春娥，陳可強

(1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)作為目前全球第四大疾病死因的呼吸系統(tǒng)疾病，以持續(xù)性的呼吸道癥狀和氣流受限為特征[1]。若治療不當或延誤治療，將產(chǎn)生眾多并發(fā)癥，其中慢性肺源性心臟病便是COPD最常見的并發(fā)癥之一[2]。肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)收縮導致的低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)被認為是慢性肺源性心臟病發(fā)病的前提及核心環(huán)節(jié)[3]，但是肺動脈平滑肌收縮的機制尚未完全明確。平滑肌是一種特殊的肌肉類型，具有控制或調(diào)節(jié)收縮和松弛的能力，覆蓋呼吸系統(tǒng)中從氣管到肺組織的大部分區(qū)域。先前的研究發(fā)現(xiàn)全真一氣湯可以通過調(diào)節(jié)ACTA1改善COPD大鼠呼吸肌無力的癥狀[4]，促進呼吸肌的收縮。ACTA2是ACTA1的特異性同工型蛋白，由ACTA2基因編碼的平滑肌肌動蛋白α被認為對血管平滑肌細胞的收縮功能起關(guān)鍵作用[5-6]。在中醫(yī)學研究中，結(jié)合COPD的臨床癥狀，現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家認為COPD發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素主要與肺脾腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)，發(fā)病初期主要表現(xiàn)為肺氣虛，后期累及腎臟。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)[7-9]，對COPD腎不納氣證患者進行西醫(yī)治療配合內(nèi)服全真一氣湯中藥湯劑能夠顯著改善癥狀，延緩肺動脈高壓的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量，但作用機制尚不明確。為進一步探索全真一氣湯的多靶點機制，研究使用全真一氣湯干預COPD大鼠，通過檢測大鼠肺組織中ACTA2基因及蛋白水平，探討全真一氣湯對肺動脈平滑肌收縮功能的調(diào)節(jié)作用。

1 主要材料與試劑

1.1 動物

SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，清潔級。采購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心(NO：70092411)。于福建中醫(yī)藥研究院動物實驗中心鼠類實驗室進行本研究醫(yī)學實驗，清潔級。動物使用符合福建省醫(yī)學實驗動物管理委員會管理條例。

1.2 藥物

根據(jù)明末清初醫(yī)家馮楚瞻[10]所著《馮氏錦囊秘錄》中的名方全真一氣湯將生藥制成40%的濃縮湯劑(組方：生曬參15 g，麥門冬15 g，熟地黃15 g，黑順片6 g，炒白術(shù)6 g，川牛膝15 g，五味子6 g)。中藥制法：①稱量藥材226 g，經(jīng)蒸餾水浸30 min后煮沸，煮沸后再煎30 min，注意均勻攪拌，再經(jīng)3層紗布過濾，取濾液；②得濾渣，加入蒸餾水再次將其煮沸后續(xù)煎20 min，再經(jīng)3層紗布過濾，取濾液；③將所得的2次濾液充分混勻后，將其濃縮成含原材料1.0 g/mL的水煎液226 mL。藥液常溫冷卻后，放至4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。原藥材采購于福建省藥材公司，濃縮中藥湯劑由福建省第二人民醫(yī)院制劑中心制作。

1.3 試劑與儀器

兔抗大鼠ACTA2抗體(美國Santa Craz公司)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，編號：D379212)；ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司，編號：DRR037A)；SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(TaKaRa公司，編號：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，編號：D9108A)；7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Westen-blotting(美國BIO-RAD)。

2 方法

2.1 分組

采用隨機數(shù)字表法將18只清潔級健康雄性大鼠隨機分為中藥組與模型組，每組各9只。

2.2 動物模型建立

采用10%水合三氯乙醛于實驗第1天、第11天、第21天經(jīng)腹腔注射麻醉兩組大鼠，取仰臥位，固定四肢及頭部，行手術(shù)切開氣管，經(jīng)氣管注入內(nèi)毒素脂多糖200 μL(1 mg/mL)。旋轉(zhuǎn)固定板，盡可能地使內(nèi)毒素脂多糖充分均勻地分布于大鼠雙肺。自制有機玻璃熏箱，熏箱的大小規(guī)格為30 cm×40 cm×50 cm。第2天起將所有大鼠置于該熏箱內(nèi)進行COPD造模，箱內(nèi)煙熏濃度設(shè)置為5%。除氣管內(nèi)滴注日不對大鼠進行煙熏外，每天均保持煙熏30 min，持續(xù)煙熏60 d。造模期間觀察小鼠的一般情況。

2.3 給藥方法

自第2天起，于每日上午8-9點，在熏煙前對中藥組大鼠給予藥物灌胃干預。灌胃前稱量大鼠體質(zhì)量，按照0.4 mL/20 g的藥物劑量每日灌胃1次。模型組大鼠每日予0.9%生理鹽水5 mL灌胃1次。灌胃給藥前利用水浴法升高濃縮湯劑溫度至與大鼠正常體溫38 ℃接近，連續(xù)灌服60 d。

2.4 樣本取材

經(jīng)過60 d持續(xù)煙熏完畢，采取隨機取樣原則，每組隨機選擇3只大鼠樣本，將樣本大鼠頸椎脫臼處死后，浸入75%濃度的乙醇溶液中，5 min后將轉(zhuǎn)移樣本大鼠到超凈工作臺，隨后樣本大鼠仰面固定于解剖臺上，用75%乙醇消毒胸部后，沿胸部正中線剪開皮膚，充分暴露樣本大鼠胸腔，取右肺組織后利用消毒完畢的錫箔紙包裹標本并放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中保存，以便用于實時熒光定量PCR及Western blot檢測。

2.5 觀察指標與測定方法

2.5.1 一般狀況 每日觀察兩組大鼠的毛發(fā)光澤、呼吸情況、精神狀態(tài)、飲食及攝水量狀況及重量改變情況等。

2.5.2 實時熒光定量PCR檢測 取大鼠右肺組織標本100 mg于研缽中加液氮快速研磨，總RNA采用TRIzol(invitrogen)法抽提取，總RNA提取后加入DNA酶對基因組進行消化，用ExScriptTM RT Reagent Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒以7500 Software v 2.0.5進行熒光擴增。使用SYBR Green I嵌合熒光法，Genebank序列(寶生物工程(大連)有限公司)檢測基因的上下游引物序列，見表1。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參照。以模型組mRNA的表達量為“1”，再依據(jù)校正值計算中藥組mRNA的含量，并比較各組間表達量。所有步驟均嚴格按照試劑盒操作流程進行。

表1 檢測基因的引物序列和產(chǎn)物長度

2.5.3 Western blot檢測ACTA2蛋白水平 按1∶10的比例將稱量后大鼠右肺組織塊生理鹽水沖洗后加入相應的裂解液中，充分混勻后低溫離心，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。加入緩沖液，100 ℃變性，取20 μg電泳，電泳完畢后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。室溫下將膜封閉于5%的脫脂奶粉中1 h，加入一抗(ACTA2；CST公司)，在4 ℃下孵育過夜。隔日加入二抗(碧云天)，在室溫下孵育1 h后使用TBST將膜充分洗滌，ECL檢測標本膜上的信號。

2.5.4 統(tǒng)計學分析 各組數(shù)值用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀況比較

兩組大鼠均無死亡。兩組大鼠熏煙初期均喜扎堆聚集，后漸出現(xiàn)咳嗽、噴嚏、喘息等癥狀。模型組大鼠精神倦怠、靜臥懶動、呼吸困難，胸廓活動明顯，出現(xiàn)點頭運動，并有較多質(zhì)地清稀的分泌物自鼻腔流出，毛發(fā)枯黃，部分大鼠有毛發(fā)脫落現(xiàn)象，飲食及攝水量減少，大便稀軟，體質(zhì)量減輕。而中藥組大鼠一般狀況較模型組有所改善。

3.2 PCR結(jié)果

中藥組ACTA2mRNA的表達相比于模型組有所下調(diào)，表達豐度是模型組的0.718倍。P值為0.017，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。如圖1、表2。

注：中藥組與模型組比較，P<0.05。

表2 各組COPD大鼠ACTA2mRNA表達豐度

3.3 Western blot檢測

中藥組較模型組ACTA2mRNA蛋白表達降低。

4 討論

近年來，我國40歲以上人群中COPD的發(fā)病率呈進行性增長，但其公眾知曉率卻未明顯升高[11]。這也致使患者在首次求診時大多癥狀已較為嚴重，給診治增加了困難。目前COPD的西醫(yī)治療方案主要是通過應用支氣管擴張劑(包括β2腎上腺素受體激動劑、抗膽堿能藥物及茶堿類藥)和糖皮質(zhì)激素從而達到控制疾病發(fā)作的效果，但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)存在相當一部分的患者運用目前的治療手段對癥處理后病情并無明顯的控制。該部分患者繼發(fā)HPH的概率便會增加，其生活質(zhì)量將會降低。而由于COPD患者的長期缺氧繼發(fā)引起的HPH在發(fā)生初期并無明顯的特異性臨床表現(xiàn)，故許多COPD患者繼發(fā)HPH時常不能獲得明確診斷，延誤病情，錯過了早期的治療時間。

圖2 各組COPD大鼠ACTA2mRNA表達豐度

隨著現(xiàn)代對傳統(tǒng)醫(yī)學研究的深入，中醫(yī)藥在內(nèi)科學各方面疾病中表現(xiàn)出不俗的療效。國內(nèi)許多臨床試驗[12]已證實在COPD階段進行中醫(yī)藥配合干預可以有效防治HPH的發(fā)生，達到“治未病”的效果?，F(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家普遍認為COPD是一種病程較長，病性以虛為主的慢性虛損性肺系疾病。肺主一身之氣，腎主納肺吸入之清氣，兩臟協(xié)調(diào)有序則氣機升降出納均勻有度，衛(wèi)氣、宗氣強勁，周轉(zhuǎn)流利，諸邪不干。然，COPD患者多見為中老年人，年事漸高，素體漸衰，正氣漸損。肺為嬌臟，本就易感邪致病，臟腑正氣一旦虧損則易令肺衛(wèi)不固，致使邪氣侵襲肺臟，進而使五臟六腑發(fā)生一系列生理及病理的變化，令病情遷延難愈。肺金與腎水為母子之臟，母病常多及子。久咳傷肺，肺病及腎，則腎氣虧虛，腎虛不能攝納，故常表現(xiàn)為肺氣不足，腎納氣不利的癥狀。若肺臟吸入的清氣不能被腎臟所攝納，清氣便游走于氣道與血脈之間，無法與機體組織進行充分的氣體交換，誘發(fā)低氧性肺動脈高壓。明代醫(yī)家李士材在《醫(yī)宗必讀》提出：“正氣不足，而后邪氣踞之”?！端貑枴ぴu熱病論篇》亦有云曰：“邪之所湊，其氣必虛”。因此，在COPD的中醫(yī)治療過程中，應重視補腎益肺，始終注意扶正培本。肺氣與腎氣得到補充便能更充分發(fā)揮臟腑功能，吸納更多的自然清氣來緩解缺氧癥狀，從根本上調(diào)節(jié)肺動脈的壓力。這也與現(xiàn)代醫(yī)學認為提高機體免疫力可改善COPD患者一般情況的觀念相符合。全真一氣湯全方扶正祛邪，潤燥合宜，是治療肺腎氣虛，腎不納氣的名方。方中熟地黃味甘性微溫，入肝腎二經(jīng)，為君藥，配伍臣藥味甘性微寒之麥門冬，上可養(yǎng)陰潤肺，下可滋陰濟腎；佐以性溫之生曬參大補元氣，性大熱之黑順片補火助陽；君臣二藥藥力所化陰液得參、附溫熱之性以氣化，上則布津散液于肺，益肺生津，下則輸精于腎，補腎填精；白術(shù)為甘溫之藥，歸脾胃經(jīng)，炒制更添健脾益氣之效，與君臣二藥共劑相配，補益脾土而不至溫燥太過，滋補陰液而不過分黏滯；而牛膝作為引經(jīng)藥，引火下行，再加五味子納氣藏源，則可使土金水三臟均調(diào)，一氣而化源。

ACTA2基因位于人類染色體10q23.31，其編碼的ACTA2是人類目前已確定的6種肌動蛋白亞型之一。血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的收縮過程依賴于由ACTA2組成的微絲與由β-肌球蛋白組成的粗絲之間的循環(huán)相互作用[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，ACTA2與煙霧病[14]、動脈瘤[15]、器官纖維化[16]等疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)聯(lián)。肌動蛋白是構(gòu)成細胞骨架的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。這種基因的突變或缺失會致使ACTA2構(gòu)成細胞骨架的功能發(fā)生缺陷[17]，誘發(fā)與血管疾病有關(guān)的多系統(tǒng)平滑肌功能障礙。動脈血管的縮窄[18]便是該類患者其中的病理特征之一。當表達ACTA2的平滑肌細胞大量沉積肺動脈壁中，肺血管便會發(fā)生重構(gòu)，導致肺動脈血管的高壓力的產(chǎn)生，甚至發(fā)生右心衰[19]。我們可以認為，肺血管管腔的縮小是肺血管重構(gòu)的直接結(jié)果，肺動脈高壓是肺血管管腔縮小的癥狀表現(xiàn)。而除了血管重構(gòu)之外，肺血管的收縮也會導致肺血管管腔的縮小。COPD患者由于持續(xù)的氣流受限，導致肺通氣功能發(fā)生障礙從而發(fā)生缺氧，表現(xiàn)出不同程度的低氧血癥。機體可通過收縮肺肌性小動脈重新分配血液，將其由低通氣肺泡調(diào)節(jié)至通氣好的肺泡中，從而減輕低氧狀態(tài)下肺部通氣/灌注不匹配的情況。由于COPD患者缺氧狀態(tài)持續(xù)進行且不可逆，會引起肺血管的逐步收縮，導致肺動脈壓力逐步增加。通過對COPD患者繼發(fā)HPH的相關(guān)危險因素分析也發(fā)現(xiàn)肺動脈壓力與血氧飽和度之間存在較高相關(guān)性[20]。由于氧傳感器感知到血氧分壓(Partial pressure of oxygen，PO2)的降低，導致能引起肺動脈收縮的細胞信號系統(tǒng)被激活[21]。因此，低氧被視為是引起PASMCs收縮，致使HPH形成的原因之一[22]。

以往關(guān)于PASMCs收縮機制的研究多集中在離子通道、血管活性因子及氣體信號分子等方面。如 Ca2+濃度增加是平滑肌收縮的直接因素[23]。缺氧可以引起肌漿網(wǎng)鈣離子釋放肌醇和細胞外鈣離子內(nèi)流，增加胞內(nèi)游離鈣水平，觸發(fā)PASMCs收縮。ET-B和PGI2等[24-25]血管活性因子表達異常是導致低氧性肺血管收縮的因素。NO[26]、CO[27]、H2S[28]及H2[29]等氣體具有舒張血管的作用。近些年的研究卻發(fā)現(xiàn)，某些非編碼的RNA(如circRNA、microRNA)在HPH的發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮過作用。這也讓眾多學者把研究方向集中在探究非編碼RNA的信號通路及靶點等領(lǐng)域。Tang[30]等研究報道，ACTA2的表達受轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Intracellular domain of NRG-1，NRG-1-ICD)的影響。TGF-β1是一種可以調(diào)節(jié)免疫應答、調(diào)控細胞增殖分化等活動的多功能性調(diào)節(jié)因子[31]。除了可以通過促進人PASMCs的增殖和遷移誘使血管重構(gòu)的發(fā)生外[32]，TGF-β1還可以增加ACTA2的基因表達[33-34]。在缺氧誘導的人PASMCs中觀察到作為血管生成積極調(diào)節(jié)因子的TGF-β1顯著上調(diào)[35]。表達上調(diào)的TGF-β1正反饋于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin-1，NRG-1)，增強了NRG-1的表達[36]，刺激并增強NRG-1-ICD進入細胞核調(diào)控基因表達的功能[37]。NRG-1-ICD在進入細胞核后能與ACTA2基因的第一個內(nèi)含子結(jié)合并誘導circACTA2生成，而作為“分子海綿”的circACTA2可以通過對MiR-548f-5p的吸附從而解除其對ACTA2表達的抑制[38]，進而上調(diào)ACTA2的表達，促進VSMCs中張力纖維的形成和細胞的收縮[36-37]。

目前現(xiàn)代藥理學中關(guān)于全真一氣湯組方藥物對ACTA2基因及其蛋白水平表達的影響的研究寥寥無幾。目前僅有研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ具有抑制TGF-β1信號通路的表達強度及降低ACTA2的合成的作用[39]。已知TGF-β1能調(diào)控ACTA2的表達，故我們推測組方藥物的部分成分可能通過對TGF-β1的影響，從而間接調(diào)控ACTA2的表達，實現(xiàn)對VSMCs收縮功能的調(diào)節(jié)。研究建立COPD大鼠模型并利用全真一氣湯對COPD大鼠進行灌胃干預后發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠的肺組織內(nèi)ACTA2mRNA的表達豐度是模型組的0.718倍，ACTA2蛋白表達下調(diào)，表明全真一氣湯可能通過下調(diào)ACTA2的表達及活化，調(diào)節(jié)COPD大鼠PASMCs的收縮功能，從而延緩HPH的發(fā)展進程。然而，全真一氣湯生藥湯劑化學成分復雜，本研究尚未明確能使ACTA2蛋白表達下調(diào)的具體成分，后續(xù)研究中可在此方面進行深入發(fā)掘。