影響右旋糖酐比旋度因素的研究

慕 娟，問(wèn)清江，鄭巧霞，孫曉宇，丁 浩

( 陜西省微生物研究所， 陜西 西安 710043)

右旋糖酐(Dextran)是主要由葡萄糖α-1,6糖苷鍵連接而成的葡聚糖[1]，具有增加血容量、改善微循環(huán)、防止彌散性血管內(nèi)凝血的作用，主要用于治療失血性休克，是目前公認(rèn)的優(yōu)良血漿代用品之一。臨床上應(yīng)用的常有3種規(guī)格產(chǎn)品：右旋糖酐70、右旋糖酐40、右旋糖酐20。右旋糖酐的生產(chǎn)原理：蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌(Leuconstocmesenteriodes)產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成右旋糖酐(粗酐)，粗酐進(jìn)一步水解、分離純化為藥品右旋糖酐[2～3]。一切糖類都有不對(duì)稱碳原子，所以都具有旋光性，旋光性是鑒定糖的一個(gè)重要指標(biāo)[4]。偏振光透過(guò)長(zhǎng)1 dm且1 mL中含有旋光物質(zhì)1 g的溶液，在一定波長(zhǎng)與溫度下測(cè)得的旋光度。測(cè)定的比旋度可以區(qū)別和檢查物質(zhì)的純雜度程度，亦可以用以測(cè)定含量[5]。比旋度可以衡量右旋糖酐的純度，是產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)重要指標(biāo)。右旋糖酐的生產(chǎn)過(guò)程中所涉及到的糖主要有右旋糖酐、蔗糖、果糖和葡萄糖，它們都有各自的比旋度(表1)。我國(guó)右旋糖酐產(chǎn)品的比旋度和日本、歐美等國(guó)家存在差異(表2)，這不僅僅是數(shù)據(jù)的差異，實(shí)質(zhì)是產(chǎn)品純度的差別，單從比旋度這一指標(biāo)來(lái)看，我國(guó)右旋糖酐產(chǎn)品純度低于其他國(guó)家。在右旋糖酐生產(chǎn)過(guò)程中，蔗糖是發(fā)酵的主要原料，果糖是產(chǎn)量大于右旋糖酐的主要發(fā)酵產(chǎn)物，葡萄糖主要產(chǎn)生于右旋糖酐的水解，這三者是右旋糖酐生產(chǎn)過(guò)程中需要去除的主要糖類雜質(zhì)，它們的殘存影響右旋糖酐的質(zhì)量，通過(guò)比旋度可以表現(xiàn)出來(lái)。因此右旋糖酐的比旋度不僅是產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)，而且要作為工藝過(guò)程中的考察指標(biāo)，將其影響因素作為研究對(duì)象，既可以改進(jìn)生產(chǎn)工藝，又可提高產(chǎn)品質(zhì)量。以右旋糖酐40作為對(duì)象，分別以粗酐、發(fā)酵液和膜處理發(fā)酵液為原料，采取鹽酸水解和右旋糖酐酶酶解制備右旋糖酐40，采用乙醇分離純化和膜分離純化兩種不同方法從水解液中分離右旋糖酐40，對(duì)工藝過(guò)程和產(chǎn)品的比旋度進(jìn)行檢測(cè)分析，從而探究對(duì)右旋糖酐40比旋度的影響因素。

表1 右旋糖酐生產(chǎn)過(guò)程中所涉及糖在20℃(鈉光)時(shí)的比旋度[4]

表2 不同國(guó)家右旋糖酐40比旋度[5～7]

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖(D-(+)-Glucose), 果糖(D-(-)-Fructoes),Sigma 公司產(chǎn)品；蔗糖(AR)；其他試劑為市售分析純。

1.1.2 粗酐 陜西省微生物研究所自制。

1.1.3 儀器 WZZ-2S自動(dòng)旋光儀(上海光學(xué)儀器五廠有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)； 2010A-HT高效液相色譜儀(蘇州貝銳儀器科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗酐水解制備右旋糖酐40 粗酐濃度6%，鹽酸0.1%，溫度95℃，水解時(shí)間2.5 h，水解結(jié)束按照1%加入粉末活性炭，95℃攪拌保溫40min，過(guò)濾收集濾液，乙醇分級(jí)純化分離右旋糖酐40。

1.2.2 發(fā)酵液水解制備右旋糖酐40 按照鹽酸0.16%，溫度95℃，水解時(shí)間3.5 h水解右旋糖酐發(fā)酵液，水解結(jié)束按照1%加入粉末活性炭，95℃攪拌保溫40min，過(guò)濾收集濾液，乙醇分級(jí)純化分離右旋糖酐40。

1.2.3 膜處理發(fā)酵液水解制備右旋糖酐40 發(fā)酵液經(jīng)板框過(guò)濾，陶瓷膜微濾，濾過(guò)液經(jīng)5 000膜超濾分理去除果糖等小分子，超濾截留液為發(fā)酵液處理液；在鹽酸濃度0.08%，水解時(shí)間3.0h，溫度95℃條件下水解；水解結(jié)束按照1%加入粉末活性炭，95℃攪拌保溫40 min，過(guò)濾收集濾液；濾液經(jīng)過(guò)5 000，10 000，20 000，50 000和100 000超濾膜多種組合分離右旋糖酐40。

1.2.4 比旋度測(cè)定[5]精密稱取樣品，加水溶解并定量稀釋成每1 mL中約含10 mg的溶液，在25℃時(shí)，依法測(cè)定比旋度(通則0621)。

1.2.5 分子量與分子量分布[5]取樣品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過(guò)夜作為供試品溶液。另取4～5個(gè)已知分子量的右旋糖酐對(duì)照品，依法檢查(通則0514)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)右旋糖酐比旋度的影響

粗酐經(jīng)過(guò)鹽酸水解，活性炭吸附除雜，過(guò)濾收集濾液按照43.5%加入乙醇，攪拌均勻，40℃保溫20 h，傾出上清液，棄去沉淀。上清液分別以52%，53%，54%，55%，56%不同濃度繼續(xù)加入乙醇，室溫放置24 h，傾出上清液，收集沉淀，干燥取樣檢測(cè)比旋度(表3)。

表3 乙醇濃度對(duì)右旋糖酐比旋度的影響(1)

粗酐經(jīng)過(guò)右旋糖酐酶酶解，活性炭吸附除雜，過(guò)濾收集濾液，分別54%，55%，56%不同濃度加入乙醇，室溫放置24 h，傾出上清液，收集沉淀，干燥取樣檢測(cè)比旋度(表4)。乙醇分離純化采用了兩種方法，兩次分化和一次分化，從表3～表4可以看出，待分溶液相同的條件下，隨著乙醇濃度的增加，比旋度下降，也就是分離得到的右旋糖酐的雜質(zhì)增多。原因在于，右旋糖酐分子量越大，沉淀需要的乙醇濃度越低，乙醇濃度增加，可以沉淀更多的小分子糖類及其他雜質(zhì)。

表4 乙醇濃度對(duì)右旋糖酐比旋度的影響(2)

2.2 多級(jí)分離純化對(duì)右旋糖酐比旋度的影響

不同濃度的乙醇可以沉淀出不同分子量的右旋糖酐，分子量越大，沉淀時(shí)需要的乙醇濃度越低，相反分子量越小，沉淀時(shí)需要的乙醇濃度越高，右旋糖酐的分離純化就是依據(jù)這一特征進(jìn)行的。一般情況下，對(duì)于高分子右旋糖酐水解液采用乙醇多級(jí)分離純化，可以得到不同分子量的右旋糖酐產(chǎn)品。表5是采用四級(jí)乙醇分離純化時(shí)測(cè)定的比旋度，從中可以看出，三級(jí)純化的比旋度均低于同一水解液出發(fā)的四級(jí)純化比旋度。這一結(jié)果與2.1結(jié)果不同，原因在于三級(jí)分化的乙醇濃度為54%，收集沉淀后的上清液繼續(xù)加入乙醇至60%，溶液體積增大，溶液中的雜質(zhì)濃度變小，四級(jí)沉淀時(shí)，裹夾在沉淀產(chǎn)品中的雜質(zhì)相應(yīng)降低，四級(jí)產(chǎn)品比旋度高于三級(jí)，四級(jí)分離純化產(chǎn)品的純度高于三級(jí)。

表5 多級(jí)分離純化對(duì)右旋糖酐比旋度的影響

2.3 不同水解原料和方法對(duì)右旋糖酐比旋度的影響

2.3.1 粗酐水解對(duì)右旋糖酐比旋度的影響 粗酐分別進(jìn)行了鹽酸水解和右旋糖酐酶解制備右旋糖酐40，乙醇分離沉淀右旋糖酐40采取了不同的方法，分級(jí)分離和一次性沉淀(表6～表8)，結(jié)果表明，分級(jí)沉淀優(yōu)于一次性沉淀；分級(jí)沉淀分離中分別進(jìn)行直接取出沉淀和75%乙醇洗滌沉淀，后者優(yōu)于前者，尤其是粗酐鹽酸水解，75%乙醇洗滌沉淀后比旋度從+176.1提高到+192.4，提高9.25%；右旋糖酐酶酶解粗酐的產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于鹽酸水解產(chǎn)品，直接取出沉淀產(chǎn)品的比旋度分別為+192.7和+176.1，75%乙醇洗滌沉淀產(chǎn)品分別為+196.6和+192.4，酶解直接取出沉淀產(chǎn)品與鹽酸水解75%乙醇洗滌沉淀產(chǎn)品在同一水平，比旋度達(dá)到中國(guó)藥典產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，酶解75%乙醇洗滌沉淀產(chǎn)品比旋度達(dá)到日美歐產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，位于國(guó)際最高水平。右旋糖酐酶酶解粗酐制備右旋糖酐40產(chǎn)品的比旋度高于鹽酸水解制備產(chǎn)品的原因在于，鹽酸水解存在殘留蔗糖、小分子右旋糖酐與大分子右旋糖酐的競(jìng)爭(zhēng)水解，且前者競(jìng)爭(zhēng)性大于后者，結(jié)果導(dǎo)致蔗糖優(yōu)先降解為果糖和葡萄糖，小分子右旋糖酐進(jìn)一步降解為更小的雜糖分子，水解液分子量分布不均，小分子類雜質(zhì)過(guò)多；右旋糖酐酶具有專一性，且右旋糖酐分子量越大與右旋糖酐酶的親和力越強(qiáng)，阻止了殘留蔗糖的水解，改善了酶解液分子量的分布，克服了鹽酸水解小分子雜質(zhì)過(guò)多的缺點(diǎn)[8～9]。

表6 粗酐鹽酸水解乙醇分級(jí)分離純化右旋糖酐的比旋度

表7 粗酐右旋糖酐酶酶解乙醇分級(jí)分離純化右旋糖酐的比旋度

表8 粗酐右旋糖酐酶酶解90%乙醇一次沉淀分離右旋糖酐的比旋度

2.3.2 發(fā)酵液水解對(duì)右旋糖酐比旋度的影響 右旋糖酐發(fā)酵液直接水解制備右旋糖酐40，優(yōu)點(diǎn)在于可以簡(jiǎn)化工藝，降低耗材，提高產(chǎn)率。腸膜狀明串珠菌Lm-1226以蔗糖為主要原料，在其產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶的作用下將蔗糖轉(zhuǎn)化為右旋糖酐和果糖，發(fā)酵液中果糖的量稍大于右旋糖酐，另外還有蔗糖殘留；發(fā)酵液水解后還有葡萄糖等。因此分離純化的負(fù)荷增加，需要在產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)率之間尋找平衡點(diǎn)。右旋糖酐發(fā)酵液鹽酸水解乙醇分級(jí)沉淀結(jié)果見(jiàn)表9，直接取出沉淀產(chǎn)品的比旋度+170.3，75%乙醇洗滌沉淀產(chǎn)品的比旋為+178.0，產(chǎn)品比旋度提高4.5%，但是沒(méi)有達(dá)到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。將右旋糖酐發(fā)酵液鹽酸水解制備的右旋糖酐產(chǎn)品采用乙醇再沉淀方法進(jìn)一步分離純化(表10)，經(jīng)過(guò)乙醇在沉淀，產(chǎn)品的比旋度均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但是分子量分布卻發(fā)生了變化。No1所用的原料是53%乙醇分離純化的產(chǎn)品，No2和No3所用的原料是54%乙醇分離純化的產(chǎn)品，再沉淀試驗(yàn)中分別選取了原來(lái)沉淀的乙醇濃度和另外一個(gè)乙醇濃度，分子量分布均發(fā)生了變化，原沉淀乙醇濃度變化最大，重均分子量平均提高8.77%，隨著乙醇濃度的進(jìn)一步提高，對(duì)分子量的分布降低，60%、65%和70%乙醇濃度再沉淀后重均分子量的提高分別為4.79%、3.26%和3.31%。分離純化的右旋糖酐產(chǎn)品不是單一分子量的的物質(zhì)，而是具有重均分子量和一定分子量分布的物質(zhì)，其中既有一定要求的大分子和小分子，溶解后再次沉淀，部分小分子不會(huì)沉淀，乙醇的再沉淀會(huì)改變重均份力量和分子量分布，提高乙醇濃度會(huì)降低這種變化。因此在采用乙醇再沉淀要考慮到這一點(diǎn)，根據(jù)分子量分布，選擇適合的乙醇濃度。

表9 右旋糖酐發(fā)酵液鹽酸水解乙醇分級(jí)分離純化右旋糖酐的比旋度

表10 乙醇再沉淀分離純化右旋糖酐

表11 右旋糖酐發(fā)酵液酶解乙醇分級(jí)分離純化右旋糖酐的比旋度

右旋糖酐酶降解右旋糖酐發(fā)酵液,乙醇分級(jí)分離純化的結(jié)果見(jiàn)表11，直接取出沉淀的比旋度為+171.7，75%乙醇洗滌沉淀1次的比旋度增加至+182.2，比旋度提高10.6；75%乙醇洗滌沉淀2次的比旋度增加至+187.1，比旋度提高15.4； 75%乙醇洗滌沉淀5次的比旋度增加至+190.6，比旋度提高18.9，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3 膜處理發(fā)酵液水解對(duì)右旋糖酐比旋度的影響 右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾、陶瓷膜微濾和超濾膜超濾之后鹽酸水解，分離純化選擇兩種不同途徑，乙醇分級(jí)分離純化結(jié)果見(jiàn)表12，產(chǎn)品比旋度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；超濾膜分離和60%乙醇一次性沉淀組合結(jié)果見(jiàn)表13，產(chǎn)品比旋度有所提高，平均達(dá)+194.7，其中還有達(dá)到國(guó)際最高標(biāo)準(zhǔn)+195.0。發(fā)酵液膜處理分離出的右旋糖酐可以達(dá)到傳統(tǒng)工藝中乙醇沉淀的粗酐水平，前者可以替代后者，可以得到發(fā)酵液中的主要副產(chǎn)物果糖，大大減少乙醇用量，省去粗酐溶解工藝過(guò)程。膜處理發(fā)酵液水解，水解液利用超濾膜和乙醇沉淀組合提高產(chǎn)品品質(zhì)，有望達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。

表12 膜處理發(fā)酵液鹽酸水解乙醇分級(jí)分離純化右旋糖酐的比旋度

表13 膜處理發(fā)酵液鹽酸水解膜分離+ 60%乙醇一次性沉淀右旋糖酐的比旋度

3 結(jié)論

右旋糖酐的比旋度是衡量產(chǎn)品的一個(gè)重要指標(biāo)，右旋糖酐生產(chǎn)過(guò)程中的蔗糖、果糖、葡萄糖等主要小分子糖類物質(zhì)是影響其的一個(gè)主要方面。從發(fā)酵液開(kāi)始的不同分離純化，不同水解方法等工藝過(guò)程來(lái)探究影響右旋糖酐產(chǎn)品比旋度的各種影響因素。同一右旋糖酐水解溶液應(yīng)用乙醇沉淀法分離純化時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，比旋度下降，也就是分離得到的右旋糖酐的雜質(zhì)增多，產(chǎn)品品質(zhì)降低。多級(jí)乙醇沉淀分離純化右旋糖酐時(shí)，在一定范圍內(nèi)，后面(乙醇濃度高)分離得到的右旋糖酐比旋度大于前面(乙醇濃度低)的右旋糖酐，也就是高濃度乙醇沉淀產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于底濃度乙醇沉淀產(chǎn)品。以粗酐、右旋糖酐發(fā)酵液、膜處理右旋糖酐發(fā)酵液分別作為原料鹽酸水解制備右旋糖酐40，粗酐和膜處理右旋糖酐發(fā)酵液獲得產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于發(fā)酵液獲得的產(chǎn)品，粗酐水解液乙醇分級(jí)沉淀分離純化產(chǎn)品比旋度+192.4，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；膜處理右旋糖酐發(fā)酵液水解液，乙醇分級(jí)沉淀分離純化產(chǎn)品比旋度+191.9，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，膜分離和乙醇一次性沉淀組合分離純化產(chǎn)品平均比旋度+194.7，有望達(dá)到國(guó)際最高標(biāo)準(zhǔn)(+195.0)；發(fā)酵液水解液乙醇分級(jí)純化產(chǎn)品比旋度+178.0，進(jìn)一步采用乙醇再次沉淀分離純化產(chǎn)品比旋度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)+190以上。右旋糖酐的水解采用右旋糖酐酶的酶解和鹽酸水解兩種方法，酶解產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于鹽酸水解產(chǎn)品品質(zhì)，粗酐鹽酸水解產(chǎn)品達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，而粗酐酶解產(chǎn)品比旋度+196.6，達(dá)到國(guó)際最高標(biāo)準(zhǔn)；右旋糖酐發(fā)酵液鹽酸水解采用了乙醇分級(jí)沉淀和乙醇再沉淀組合分離純化產(chǎn)品比旋度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，右旋糖酐發(fā)酵液酶解只用了乙醇分級(jí)沉淀分離純化產(chǎn)品比旋度就達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。用75%的乙醇洗滌沉淀除雜是一個(gè)重要的工藝環(huán)節(jié)，無(wú)論應(yīng)用那種原料水解或那種水解方法，在目標(biāo)沉淀得到后，經(jīng)過(guò)洗滌后可以提高產(chǎn)品比旋度，多次洗滌效果更好。