毛細(xì)支氣管炎患兒鼻分泌物抗菌肽水平與急性期病情嚴(yán)重程度及反復(fù)喘息的相關(guān)性研究

韓冰，商靜敏，申永靜，李賢偉，趙麗靜

(邯鄲市婦幼保健院 小兒呼吸科，河北 邯鄲 056001)

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒最常見(jiàn)的急性下呼吸道感染，其臨床表現(xiàn)從有輕度下呼吸道癥狀到下呼吸道阻塞引起的嚴(yán)重呼吸窘迫等[1- 3]?？咕氖且环N陽(yáng)離子肽，構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的基本元素，其在呼吸道中的作用尤為重要。其中人類(lèi)β- 防御素(hBDs)和人組織蛋白酶抑制素抗菌肽18(human cathelicidin anti- microbial peptide 18，hCAP- 18)是呼吸道先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素。hCAP- 18可被切割成唯一有生物活性的N端含有雙亮氨酸的37個(gè)氨基酸殘基的小分子肽(37 amino acid residues with dileucine at the N- terminus，LL- 37)[4]，近期的研究[4- 6]支持了其在新的抗病毒策略中的治療潛力。此外有實(shí)驗(yàn)室研究表明，維生素D在感染時(shí)可上調(diào)抗菌肽LL- 37的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生抑制炎癥，進(jìn)而減輕病毒性下呼吸道感染的嚴(yán)重程度[7]。然而目前尚缺乏相關(guān)研究，本研究旨在分析LL- 37及hBD2的黏膜生成與毛細(xì)支氣管炎患兒血清維生素D水平、急性期病情嚴(yán)重程度及反復(fù)喘息之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性隊(duì)列研究，于2017年2月至2020年4月在我院小兒呼吸科進(jìn)行。研究方案在啟動(dòng)前獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與本研究?jī)和母改妇橥?。共納入101例毛細(xì)支氣管炎患兒，男55例(占54.46%)，年齡0.8～15.9歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 年齡≤16歲；(2) 首次因患毛細(xì)支氣管炎住院治療；(3) 毛細(xì)支氣管炎被定義為以咳嗽、呼吸急促和胸部收縮為特征的第一次喘息發(fā)作，經(jīng)體格檢查及胸部X線檢查符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第七版)》[8]中毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 母親妊娠期短于34周的早產(chǎn)兒，有既往喘息史、慢性肺病、先天性心臟病、神經(jīng)發(fā)育障礙、免疫缺陷和免疫抑制、過(guò)敏性鼻炎、支氣管內(nèi)存在異物、寄生蟲(chóng)感染；(2) 預(yù)防性使用帕利珠單抗；(3) 合并嚴(yán)重肝、腎器官功能障礙。

1.2 基線數(shù)據(jù)和樣本采集

收集患兒的年齡、性別、體重、身高、體溫、脈搏、既往呼吸道感染史、癥狀、病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果、抗生素使用史、住院治療時(shí)間，以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MONO)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LY)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、降鈣素原(PCT)水平]。在初次接觸、未進(jìn)行醫(yī)療干預(yù)之前，所有患兒完成抽血和鼻咽拭子檢查。血液樣本均在采血后1 h內(nèi)3 000 r·min-1離心10 min。鼻分泌物采用真空輔助吸引法收集，無(wú)化學(xué)刺激，避免異物進(jìn)入鼻液。輕柔地操作鼻道內(nèi)裝有窄橡膠頭的真空裝置，輕度刺激鼻腔分泌物，標(biāo)本采集后立即用抑肽酶(0.6 TIU·ml-1)處理，以阻止蛋白水解酶的作用。樣本均于-20 ℃下冷凍保存，待進(jìn)一步分析。

1.3 樣本檢測(cè)

使用Abbott ARCHITECT化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析法測(cè)定25- 羥維生素D[25(OH)D]水平。另外采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)Phoenix Pharmaceutical公司)定量檢測(cè)hBD2及LL- 37水平。所有ELISA檢測(cè)包括用于構(gòu)建分析物水平評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)都重復(fù)進(jìn)行。

1.4 急性期疾病嚴(yán)重程度

患兒臨床病情的嚴(yán)重程度在每個(gè)住院日使用改良Wang氏毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重程度評(píng)分(簡(jiǎn)稱(chēng)改良Wang評(píng)分，該評(píng)分用血氧飽和度替換患者的一般狀況；0～4.9分為輕度，5～8.9分為中度，9～12分為重度)及住院治療時(shí)間[9]進(jìn)行判定。

1.5 隨訪評(píng)估

患兒出院后，每6個(gè)月進(jìn)行1次門(mén)診或電話隨訪，記錄患兒喘息發(fā)生情況，至隨訪截止時(shí)喘息發(fā)作≥3次的患兒納入反復(fù)喘息組，<3次者納入非反復(fù)喘息組(2次發(fā)作時(shí)間間隔≥1周)，隨訪期限為2年。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 鼻分泌物抗菌肽水平與患兒臨床病理特征的相關(guān)性

患兒鼻分泌物L(fēng)L- 37和hBD2水平分別為17.63(11.67，33.30)ng·mg-1和93.39(75.92，107.29)ng·mg-1。根據(jù)鼻分泌物L(fēng)L- 37水平17.63 ng·mg-1和hBD2水平93.39 ng·mg-1的中位值，將患兒分別納入低水平組和高水平組。經(jīng)分析，LL- 37低水平組患兒脈搏>100 次·min-1及呼吸道合胞病毒(RSV)感染例數(shù)顯著高于高水平組患兒(P<0.05，表1),但hBD2低水平組和高水平組患兒的臨床病理特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 毛細(xì)支氣管炎患兒鼻分泌物抗菌肽水平與臨床病理特征的相關(guān)性 例

2.2 患兒鼻分泌物抗菌肽水平、血清25(OH)D水平與急性期疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，患兒血清25(OH)D水平與住院時(shí)間(r=-0.145，P=0.148)、改良Wang評(píng)分得分(r=-0.201，P=0.052)、鼻分泌物hBD2水平(r=0.087，P=0.388)均無(wú)關(guān)，但與鼻分泌物L(fēng)L- 37水平(r=0.257，P=0.009)呈正相關(guān)。鼻分泌物L(fēng)L- 37水平與住院時(shí)間(r=-0.343，P<0.001)、改良Wang評(píng)分得分(r=-0.495，P<0.001)呈負(fù)相關(guān)，鼻分泌物hBDs水平與住院時(shí)間(r=-0.072，P=476)、改良Wang評(píng)分得分(r=-0.032，P=754)無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步校正年齡、性別、臨床表現(xiàn)等因素后，經(jīng)多元線性回歸分析，鼻分泌物L(fēng)L- 37水平仍是改良Wang評(píng)分得分的獨(dú)立影響因素(β=-0.062，95%CI為-0.090～-0.033，P<0.001)。

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響毛細(xì)支氣管炎患兒反復(fù)喘息的臨床因素

本研究共有17例毛細(xì)支氣管炎患兒在隨訪期間發(fā)生反復(fù)喘息。經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析，脈搏及鼻分泌物L(fēng)L- 37水平都是患兒發(fā)生反復(fù)喘息的獨(dú)立影響因素(P<0.001，表2)。

表2 單因素和多因素Logistic回歸分析毛細(xì)支氣管炎患兒反復(fù)喘息的影響因素

2.4 鼻分泌物抗菌肽水平對(duì)毛細(xì)支氣管炎患兒反復(fù)喘息的預(yù)測(cè)價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析，鼻分泌物L(fēng)L- 37和hBD2水平預(yù)測(cè)毛細(xì)支氣管炎患兒反復(fù)喘息的AUC分別為0.773(95%CI為0.669～0.876)和0.555(95%CI為0.410～0.699)，見(jiàn)圖1。

3 討 論

毛細(xì)支氣管炎是一種自限性的急性呼吸系統(tǒng)疾病，但部分患兒會(huì)出現(xiàn)反復(fù)喘息[10- 11]。有研究證實(shí)，維生素D可以降低病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，它通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接、黏附連接及縫隙連接蛋白的產(chǎn)生來(lái)改善身體的物理屏障，這些蛋白可被微生物(包括病毒)感染所干擾[12- 13]。維生素D可刺激抗菌肽的產(chǎn)生，抗菌肽對(duì)各種微生物都有一定的生物活性。例如大多數(shù)病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA可增加1α- 羥化酶的表達(dá)，導(dǎo)致活性維生素D的產(chǎn)生和抗菌肽在人氣管支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)增加。因此，充足的維生素D可能通過(guò)增強(qiáng)物理屏障和增加肺上皮抗菌肽的產(chǎn)生來(lái)阻止病毒的入侵，而抗菌肽LL- 37及hBDs已被證實(shí)與病毒性呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)[14]。然而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒的血清25(OH)D僅與鼻分泌物L(fēng)L- 37水平有相關(guān)性，而與hBDs無(wú)相關(guān)性，此外急性毛細(xì)支氣管炎患兒鼻腔分泌物中抗菌肽LL- 37水平與住院時(shí)間、RSV感染以及Wang評(píng)分得分呈顯著負(fù)相關(guān)。說(shuō)明抗菌肽LL- 37可能參與了急性毛細(xì)支氣管炎的病情進(jìn)展。

LL- 37是最具抗病毒活性的抗菌肽，該肽主要存在于中性粒細(xì)胞特異性顆粒中，但也可由其他類(lèi)型的細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)產(chǎn)生和分泌。LL- 37可直接作用于一系列呼吸道病原體，包括流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、銅綠假單胞菌和RSV[15- 16]。在本研究中，感染RSV的患兒鼻分泌物L(fēng)L- 37水平更低。LL- 37在多種疾病(如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、尿路感染、銀屑病等感染性疾病，卵巢癌、肺癌等癌癥，心血管疾病等[17])中均發(fā)揮重要作用。王璐等[18]指出，哮喘患兒血清LL- 37水平顯著升高，提示其參與支氣管哮喘的發(fā)生。此外，LL- 37可通過(guò)破壞RSV包膜的完整性并阻止細(xì)胞結(jié)合來(lái)抑制RSV復(fù)制，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒活性[19]。本研究中毛細(xì)支氣管炎患兒鼻分泌物L(fēng)L- 37水平與急性期疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，而且調(diào)整多種客觀的混雜因素后亦是如此。經(jīng)分析，鼻分泌物L(fēng)L- 37水平還對(duì)患兒反復(fù)喘息的發(fā)生有良好的預(yù)測(cè)效能，這與Papadaki等[9]的研究結(jié)論相符。此外鼻腔分泌物似乎比血清更能反映肺部狀態(tài)，因此我們的研究結(jié)果可能具有潛在的重要意義。

本研究首次將低水平鼻分泌物抗菌肽與毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重程度及RSV感染聯(lián)系起來(lái)，然而尚不清楚LL- 37水平與疾病嚴(yán)重程度之間的因果關(guān)系，因此在將來(lái)需要進(jìn)一步研究LL- 37作為需要重癥監(jiān)護(hù)的毛細(xì)支氣管炎患兒潛在治療靶點(diǎn)的可靠性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，較低的鼻分泌物L(fēng)L- 37水平與毛細(xì)支氣管炎急性期疾病嚴(yán)重程度(較高的Wang氏評(píng)分得分和較長(zhǎng)的住院時(shí)間)及慢性發(fā)病率(反復(fù)喘息)顯著相關(guān)，提示檢測(cè)鼻分泌物L(fēng)L- 37水平可以預(yù)測(cè)兒童急性毛細(xì)支氣管炎的疾病進(jìn)展。我們的觀察結(jié)果將有助于進(jìn)一步研究抗菌肽在毛細(xì)支氣管炎及其遠(yuǎn)期后遺癥的病理生理學(xué)中的作用。盡管毛細(xì)支氣管炎的病理學(xué)機(jī)制很復(fù)雜，但維生素D和抗菌肽之間的關(guān)聯(lián)為治療提供了一個(gè)潛在的方向，抗菌肽LL- 37有可能是一個(gè)有吸引力的治療靶標(biāo)，為預(yù)防和治療毛細(xì)支氣管炎及其慢性疾病提供新途徑。