M6A修飾調(diào)控成脂分化的研究進(jìn)展

王靜，閆爽

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，黑龍江 哈爾濱 150000)

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)150種不同的RNA化學(xué)修飾，N6- 甲基腺苷(N6- methyladenosine,m6A)修飾是一種廣泛存在于真核生物mRNA上的堿基修飾行為，用于維持mRNA的穩(wěn)定性，是表觀遺傳學(xué)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式[1]。肥胖是導(dǎo)致代謝性疾病和癌癥發(fā)展的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素。它在世界范圍內(nèi)的日益流行引起了人們對(duì)脂肪發(fā)育和代謝功能的極大關(guān)注。為了加強(qiáng)對(duì)脂肪生成分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，研究人員已經(jīng)提出了許多調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制，包括細(xì)胞外信號(hào)、轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)和表觀基因組修飾[2- 3]。值得注意的是，m6A修飾在肥胖脂肪組織中減少，在許多與肥胖相關(guān)的生物過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，包括脂肪生成、脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗。Wang等[4]使用金華豬和長(zhǎng)白豬作為肥胖型和瘦肉型豬的模型，研究m6A基因序列中m6A基因的獨(dú)特峰，這些體內(nèi)m6A分布的差異揭示了m6A修飾的變異可能與脂肪功能及脂肪形成有關(guān)，而m6A相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)脂肪形成中發(fā)揮了特定而重要的作用。

1 m6A修飾

1.1 m6A“編寫(xiě)者”——甲基轉(zhuǎn)移酶

m6A修飾通過(guò)由甲基轉(zhuǎn)移酶樣- 3(methyltransferaselike- 3，METTL3)和同源基因METTL14異源二聚體組成的核心甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物沉積到RNA上[5]，其中METTL3作為催化亞基，METTL14促進(jìn)RNA結(jié)合。另一個(gè)與METTL3/14結(jié)合的關(guān)鍵蛋白- Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(wilms’tumour 1- associating protein，WTAP)參與最優(yōu)底物募集和METTL3/14的核定位。

1.2 m6A“橡皮擦”——去甲基酶

兩種依賴(lài)Fe2+和α- 酮戊二酸的m6A去甲基酶，主要由脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity- associated protein，F(xiàn)TO)[6]及ALKB同源5(ALKBhomolog 5,ALKBH5)[7]組成?？梢詮腞NA中去除m6A的甲基化基團(tuán)。

1.3 m6A“閱讀器”——結(jié)合蛋白

m6A結(jié)合蛋白包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白(YTH domain family proteins,YTHs)、異質(zhì)核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNPs)和胰島素樣生長(zhǎng)因子- 2mRNA結(jié)合蛋白(insulin- like growth factor- 2mRNA binding proteins,IGF2BPs)。目前已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究來(lái)探討YTH結(jié)構(gòu)域的家族蛋白1- 3(YTH domain- containing family proteins1- 3，YTHDF1- 3)、YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(YTH domain- containing protein1，YTHDC1)和YTHDC2的功能[8- 10]。m6A結(jié)合蛋白可通過(guò)調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、mRNA剪接、mRNA結(jié)構(gòu)、mRNA輸出、翻譯效率等多個(gè)過(guò)程來(lái)識(shí)別并結(jié)合m6A修飾的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)和miRNA的生物發(fā)生[11- 12]。

2 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶——METTL3抑制脂肪生成

2.1 METTL3抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)脂肪生成

m6A修飾是BMSCs和成骨細(xì)胞前體細(xì)胞譜系分配的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Wu等[13]證實(shí)METTL3的缺失會(huì)抑制骨形成和骨髓脂肪堆積。在BMSCs和成骨細(xì)胞前體中，METTL3的缺失通過(guò)m6A甲基化抑制了成骨潛能，增加了成脂分化。從機(jī)制上講，METTL3基因敲除降低了Janus激酶1(januskinase1,JAK1)的m6A水平，增加了其在豬BMSCs中的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活因子5(activator of transcription 5,STAT5)磷酸化上調(diào)，并與增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)β/JAK1的啟動(dòng)子結(jié)合，最終調(diào)節(jié)成脂過(guò)程[14]。研究對(duì)m6A修飾調(diào)控BMSCs向脂肪細(xì)胞分化的潛在分子機(jī)制提供了新見(jiàn)解，這為在干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)和肥胖癥治療中開(kāi)發(fā)更有效的治療策略鋪平了道路。

2.2 METTL3調(diào)控細(xì)胞周期抑制脂肪生成

METTL3/METL14/WTAP復(fù)合體通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)控脂肪的生成。在小鼠體內(nèi)敲除METTL3/METL14/WTAP復(fù)合體，抑制細(xì)胞周期素A2(Cyclincyclin A2,CCNA2)表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，脂肪細(xì)胞的體積變小和數(shù)量減少，脂肪生成受損，能量消耗增加，肝臟脂肪變性減輕，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島素敏感性更好[15]，從而對(duì)抗小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。M6A修飾對(duì)脂肪形成調(diào)控的復(fù)雜性可能與基因干擾的效率及體內(nèi)研究的復(fù)雜性有關(guān)。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，所有這些純合子基因敲除小鼠都是胚胎致死的，表明m6A“編寫(xiě)者”在動(dòng)物發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

因此，還需要進(jìn)一步研究甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體在脂肪生成中的作用。另一個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明鋅指蛋白217(zinc finger protein 217,ZFP217)缺失可增加m6A的表達(dá)，從而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1，CCND1)mRNA的m6A水平，并顯著減少G1期細(xì)胞數(shù)量，METTL3基因敲除挽救了siZFP217抑制的有絲分裂克隆擴(kuò)增(mitotic clonal expansion,MCE)，促進(jìn)了CCND1的表達(dá)，YTHDF2識(shí)別并降解甲基化的CCND1mRNA，導(dǎo)致CCND1表達(dá)下調(diào)[16]?？傊?，ZPF217、METTL3和YTHDF2協(xié)同作用，通過(guò)m6A修飾介導(dǎo)CCND1的表達(dá)，影響MCE過(guò)程，進(jìn)而影響脂肪形成。

3 m6A去甲基酶——FTO和ALKBH5促進(jìn)脂肪生成

3.1 FTO通過(guò)MCE促進(jìn)脂肪生成

MCE是脂肪形成的關(guān)鍵步驟，發(fā)生在脂肪細(xì)胞分化早期，F(xiàn)TO通過(guò)介導(dǎo)MCE期間關(guān)鍵細(xì)胞周期基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖。CCNA2和細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白激酶2(cyclin- dependent kinase 2,CDK2)是早期有絲分裂事件的主要調(diào)節(jié)者，通過(guò)形成介導(dǎo)S～G2期轉(zhuǎn)變的復(fù)合體，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[17]。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO的缺失促進(jìn)了CCNA2和CDK2mRNA的m6A修飾，導(dǎo)致MDI[含有胰島素(INS)、地塞米松(DEX)和3- 異丁基- 1- 甲基- 黃嘌呤(IBMX)]誘導(dǎo)的3T3L1細(xì)胞延遲進(jìn)入G2期，此外，YTHDF2識(shí)別并降解甲基化的CCNA2和CDK2mRNA，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)減少，延長(zhǎng)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制脂肪生成。學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO缺失以m6A依賴(lài)的方式抑制JAK2的豬和小鼠前脂肪細(xì)胞的表達(dá)，導(dǎo)致STAT3磷酸化增加并減弱C/EBPβ的轉(zhuǎn)錄，從而抑制早期MCE階段的脂肪細(xì)胞分化[19]。其結(jié)果對(duì)FTO介導(dǎo)的細(xì)胞周期在JAK2- STAT3- C/EBPβ信號(hào)軸轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的分子機(jī)制有了新見(jiàn)解，突出了 m6A 修飾及其調(diào)節(jié)劑在脂肪生成中的關(guān)鍵作用，是未來(lái)肥胖癥和相關(guān)代謝疾病治療有希望的靶點(diǎn)。

3.2 FTO通過(guò)改變脂肪細(xì)胞表型促進(jìn)脂肪生成

FTO對(duì)白色脂肪細(xì)胞的棕色化和能量代謝具有調(diào)節(jié)作用。在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠中，F(xiàn)TO缺乏增加了缺氧誘導(dǎo)因子1A(hypoxia- inducible factor 1,HIF1A)mRNA的m6A水平，并被m6A結(jié)合蛋白YTHDC2識(shí)別，促進(jìn)了mRNA的翻譯，增加了HIF1A蛋白的豐度。HIF1A激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1A(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1a，Ppaggc1a)、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16(PR domain- containing 16,Prdm16)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)等生熱基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的表達(dá)和棕色化過(guò)程[20]。FTO缺失小鼠表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)熱能力，并抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。m6A修飾在白色脂肪棕色化和生熱功能的表觀遺傳調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，為肥胖代謝提供了新的治療思路。

3.3 FTO通過(guò)調(diào)節(jié)代謝促進(jìn)脂肪生成

新陳代謝的調(diào)節(jié)和RNA生物學(xué)是細(xì)胞的核心。很多代謝物通過(guò)m6A來(lái)調(diào)節(jié)mRNAs。Wang等[21]用熒光猝滅試驗(yàn)篩選了一組代謝物，并確定了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate,NADP)與FTO顯著結(jié)合。在體外去甲基化分析表明，NADP可增強(qiáng)FTO活性，此外，NADP通過(guò)體內(nèi)FTO調(diào)節(jié)mRNA m6A，F(xiàn)TO的缺失阻斷了3T3- L1前脂肪細(xì)胞中NADP增強(qiáng)的脂肪生成。

3.4 FTO 在脂肪生成過(guò)程中調(diào)節(jié)自噬

Wang等[22]使用了兩個(gè)理想的細(xì)胞模型，即小鼠3T3L- 1細(xì)胞系和豬原代前脂肪細(xì)胞，首次揭示了FTO通過(guò)激活自噬促進(jìn)脂肪生成的網(wǎng)絡(luò)，并表示這種自噬在物種之間可能是高度保守的。敲除FTO會(huì)降低自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related 5,ATG5)和ATG7的表達(dá)，導(dǎo)致自噬體形成減弱，從而抑制自噬和脂肪生成。通過(guò)建立FTO- AKO的小鼠模型印證了FTO缺失減少小鼠白色脂肪量，顯著降低了自噬通量LC3- II與I的比值，提高了螯合體1(sequestosome1,SQSTM1)蛋白豐度，從而抑制ATG5和ATG7依賴(lài)的自噬。此發(fā)現(xiàn)為FTO和m6A修飾調(diào)節(jié)自噬和脂肪生成的潛在分子機(jī)制以及預(yù)防和治療肥胖癥策略的研究展現(xiàn)了新視角。

3.5 FTO在脂肪生成過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞凋亡

在脂肪細(xì)胞凋亡中，Shen等[23]研究表明，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中FTO的過(guò)表達(dá)抑制促凋亡因子Caspase- 3、Caspase- 9和Bcl- 2相關(guān)X蛋白(bcl- 2- associated X protein,BAX)以及線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response,UPRmt)標(biāo)志物熱休克蛋白60(heart shock protein,HSP60)和酪蛋白溶解蛋白酶P(caseinolyticprotease P, ClpP)的表達(dá)。最重要的是FTO的過(guò)表達(dá)抑制了脂肪細(xì)胞中線粒體依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。UPRmt誘導(dǎo)真核起始因子2α激酶2(eukaryotic initiation factor 2α kinase 2,PKR)和真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化增加，煙酰胺核糖(nasal resistance, NR)誘導(dǎo)UPRmt，激活轉(zhuǎn)錄因子5(activating transcription factor 5,ATF5)介導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因BAX通過(guò)UPRmt靶向PKR/eIF2α/ATF5途徑激活。FTO通過(guò)減少HSP60mRNA m6A修飾抑制UPRmt誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡，并激活JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制線粒體依賴(lài)性的脂肪細(xì)胞凋亡。因此學(xué)者對(duì)UPRmt的研究證實(shí)，線粒體在代謝適應(yīng)、脂肪細(xì)胞凋亡和肥胖中起著至關(guān)重要的作用。

總之，越來(lái)越多的證據(jù)支持FTO依賴(lài)的m6A去甲基化在脂肪形成中起著關(guān)鍵作用。FTO部分通過(guò)影響MCE分期、代謝物、自噬、細(xì)胞表型改變、細(xì)胞凋亡促進(jìn)脂肪生成，其他促進(jìn)脂肪生成的機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。盡管已有大量研究表明了FTO在脂肪形成中的作用，但FTO蛋白本身是如何被調(diào)控的仍然是一個(gè)令人困惑的問(wèn)題。在FTO上游機(jī)制的研究中，Song等[24]發(fā)現(xiàn)Zfp217是FTO的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，以m6A依賴(lài)的方式促進(jìn)脂肪生成，為理解m6A修飾在脂肪生成過(guò)程中的調(diào)控提供了新的視角。

3.6 ALKBH5在姜黃素的影響下調(diào)控脂肪生成

ALKBH5作為另一種去甲基酶，其在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化方面的作用也不容忽視。姜黃中的天然多酚化合物姜黃素已顯示出對(duì)肥胖和代謝疾病的保護(hù)作用。飼喂姜黃素可增加小鼠皮下腹股溝白色脂肪組織和內(nèi)臟附睪白色脂肪組織中m6A修飾，降低ALKBH5水平。ALKBH5蛋白的減少導(dǎo)致TNF受體相關(guān)因子4(TNF receptor- associated factor 4，TRAF4)mRNA的m6A 修飾增加，該修飾可被YTHDF1識(shí)別和結(jié)合，從而增強(qiáng)TRAF4在脂肪細(xì)胞中的翻譯。TRAF4作為E3環(huán)泛素連接酶，通過(guò)泛素- 蛋白酶體途徑促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化調(diào)節(jié)劑PPARγ泛素化，降低PPARγ水平，抑制脂肪細(xì)胞的成脂[25]。

4 YTH家族介導(dǎo)關(guān)鍵基因的RNA代謝調(diào)控脂肪生成

4.1 YTHDF2

m6A修飾被FTO或METTL3敲除或沉積后，YTHDF2增加或減少CCNA2[18]、CDK2[18]、JAK1/2[19,23]、Atg5或Atg7[22]等甲基化mRNA的識(shí)別和降解，從而改變靶蛋白的表達(dá)。此外研究還探討了對(duì)單個(gè)基因的mRNA修飾。Cai等[26]發(fā)現(xiàn)，具有序列相似性134的家族成員B(family with sequence similarity 134, member B,FAM134B) mRNA中m6A的缺失促進(jìn)脂肪生成，YTHDF2可能識(shí)別并結(jié)合其m6A位點(diǎn)，導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)降低。并且實(shí)驗(yàn)表明Zfp217與YTHDF2相互作用，維持FTO的m6A去甲基化活性，促進(jìn)脂肪生成。

4.2 YTHDF1

除了YTHDF2降解mRNA外，YTHDF1還通過(guò)增加蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂肪生成。Jiang等[27]在金華豬中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的甲基化基因，稱(chēng)為線粒體載體同源物2(mitochondrial carrier homolog 2,MTCH2)，它以m6A- YTHDF1依賴(lài)性方式促進(jìn)肌肉內(nèi)脂肪生成。在小鼠姜黃素給藥的實(shí)驗(yàn)中，ALKBH5和YTHDF1對(duì)m6A依賴(lài)性TRAF4表達(dá)的上調(diào)有助于姜黃素誘導(dǎo)的肥胖癥的預(yù)防[25]。

4.3 YTHDC2

M6A修飾在白色脂肪組織棕色化的最新研究進(jìn)展中提示，HIF1A以m6A- YTHDC2依賴(lài)性方式促進(jìn)UCP1的表達(dá)和產(chǎn)熱[20]。

因此，m6A修飾在調(diào)節(jié)脂肪生成方面的功能結(jié)果取決于m6A“閱讀器”對(duì)轉(zhuǎn)錄本特定m6A位點(diǎn)的讀取，以影響其RNA代謝。這些研究強(qiáng)調(diào)了m6A“閱讀器”作為mRNA甲基化和代謝的下游調(diào)節(jié)因子以m6A依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)脂肪生成的潛在作用機(jī)制。

5 展 望

綜上所述，m6A修飾主要由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶催化，m6A去甲基酶去除，并由m6A結(jié)合蛋白識(shí)別，從而參與mRNA的所有代謝過(guò)程。將近些年來(lái)m6A相關(guān)酶和蛋白在脂肪生成中的作用作一總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中m6A修飾的失調(diào)可能導(dǎo)致基因表達(dá)和功能的異常、細(xì)胞的異常分化和體內(nèi)平衡的失衡以及代謝性疾病的發(fā)生，如表1。m6A修飾的動(dòng)態(tài)可逆性質(zhì)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和生理穩(wěn)態(tài)信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用。

表1 m6A修飾相關(guān)酶及其生物學(xué)效應(yīng)

盡管越來(lái)越多研究證實(shí)m6A修飾調(diào)控脂肪生成方面有巨大的潛力。但目前仍然存在許多挑戰(zhàn)：(1) 目前研究者雖對(duì)脂肪形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但對(duì)轉(zhuǎn)錄后mRNA水平修飾的報(bào)道相對(duì)較少。(2) 由m6A調(diào)節(jié)的RNA加工和代謝的作用需要在脂肪生成，也包括在脂質(zhì)代謝中進(jìn)一步證明。(3) 研究m6A修飾的潛力尚未開(kāi)展甲基化譜研究，作為人類(lèi)代謝疾病的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)和治療的一個(gè)組成部分。從FDA系統(tǒng)中尋找針對(duì)新型m6A相關(guān)酶的“經(jīng)典”藥物可能有助于更好地應(yīng)用這些潛在藥物治療肥胖癥，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前關(guān)于m6A甲基化的研究主要集中于癌癥的診斷，未來(lái)仍需進(jìn)一步研究m6A修飾在脂肪生成中的具體分子機(jī)制及潛能，從而更好地為肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的診斷和治療提供科學(xué)理論依據(jù)。