高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

楊光萍

（貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽(yáng) 550014）

近年來(lái)，食品種類的多元化發(fā)展離不開(kāi)食品工業(yè)技術(shù)的不斷提升，而食品安全問(wèn)題也逐漸被廣大消費(fèi)者密切關(guān)注。根據(jù)各級(jí)市場(chǎng)監(jiān)督管理部門所公布的食品抽檢情況，食品微生物超標(biāo)問(wèn)題尤為凸顯。其中，致病性微生物對(duì)人體感染所造成的危害是難以預(yù)估的，因此采用更為高效、合理的食品安全檢測(cè)技術(shù)變得至關(guān)重要。目前，食品微生物檢測(cè)主要根據(jù)GB 4789系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的傳統(tǒng)培養(yǎng)、分離及鑒定方法，但存在實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、步驟煩瑣等問(wèn)題，特別是對(duì)于處理食品安全突發(fā)事件來(lái)說(shuō)存在困難。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)（High-Throughput Sequencing）在微生物群落結(jié)構(gòu)、種類鑒定、功能分析等多個(gè)方面已有較多研究[1]。本文基于高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，總結(jié)并分析其在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展，以期為食品微生物檢測(cè)技術(shù)的提升提供更多解決方案，促進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化和升級(jí)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)

Sanger等在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明了DNA末端終止法測(cè)序技術(shù)，為生物遺傳密碼的解析提供了技術(shù)上的可能。1986年，第一臺(tái)基因分析儀的面世標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)時(shí)代的到來(lái)，自此，生物學(xué)研究進(jìn)入了新的開(kāi)端。但第一代測(cè)序平臺(tái)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、通量低，直到2005年第二代測(cè)序儀問(wèn)世，使得大規(guī)模的基因組測(cè)序成為了可能[2]。目前，第三代測(cè)序儀平臺(tái)也已經(jīng)開(kāi)始得到應(yīng)用，但占據(jù)了高通量測(cè)序技術(shù)市場(chǎng)的還是第二代測(cè)序平臺(tái)。

高通量測(cè)序技術(shù)又稱為下一代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing Technology，NGS）或是深度測(cè)序（Deep Sequencing），其技術(shù)優(yōu)勢(shì)是能夠一次性對(duì)上百萬(wàn)條DNA分子并行測(cè)序，并且檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)成本更低，在生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用[3]。第二代高通量測(cè)序技術(shù)主要包括454焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing）、SOLiD測(cè)序技術(shù)（Supported Oligo Ligation Detetion）、連接酶測(cè)序技術(shù)和Solexa測(cè)序技術(shù)[4-5]，無(wú)論何種第二代測(cè)序平臺(tái)，其技術(shù)核心原理均為邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis）。

2 高通量測(cè)序技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的運(yùn)用

目前，高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)食品微生物進(jìn)行檢測(cè)的研究中多為利用16S rDNA/rRNA測(cè)序。16S rDNA是編碼核糖體16S rRNA亞基的基因序列，在微生物菌屬的基因結(jié)構(gòu)、功能上高度保守，同時(shí)具有長(zhǎng)度適中、拷貝量大、易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，因此常用于微生物的分子生物學(xué)研究中[6]。此外，運(yùn)用較多還有宏基因組/轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法。

2.1 發(fā)酵食品微生物檢測(cè)

發(fā)酵食品是最具我國(guó)民族特色的食品之一，已有上百年的生產(chǎn)和食用歷史，制作工藝成熟、食品種類豐富，最具代表性的便是腐乳和白酒。發(fā)酵技術(shù)充分利用了微生物對(duì)食品原材料中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解作用，從而形成了發(fā)酵食品獨(dú)特的風(fēng)味，因而研究微生物種群結(jié)構(gòu)和功能是提升發(fā)酵食品風(fēng)味的必經(jīng)之路。

細(xì)菌16S rRNA具有高度特異性及保守性，而真菌ITS序列具有廣泛的序列多態(tài)性，此兩種序列在微生物種屬研究中扮演著至關(guān)重要的角色[7-8]。石黎琳等[9]合成引物515F、907R、ITS1F及ITS2R，通過(guò)Illumina PE250測(cè)序，發(fā)現(xiàn)腐乳自然發(fā)酵過(guò)程中微生物菌落結(jié)構(gòu)多變化，在第一階段優(yōu)勢(shì)種群為乳球菌屬（Lactococcus）、久浩酵母屬（Guehomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和假絲酵母屬（Candida）；第二階段優(yōu)勢(shì)種群為久浩酵母屬、假絲酵母屬、假單胞菌屬、類香味菌屬（Myroides）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）；發(fā)酵第三階段優(yōu)勢(shì)種群為鏈格孢屬（Alternaria）、赤霉菌屬（Gibberella）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）和乳球菌屬。不同地方或是不同發(fā)酵工藝的腐乳，其微生物種群結(jié)構(gòu)也會(huì)有較大的差異。萬(wàn)紅芳等[10]通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA及真菌18S rRNA利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)研究發(fā)現(xiàn)，2種夾江腐乳中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似，且優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群為芽孢桿菌屬（Bacillus），但真菌種群結(jié)構(gòu)具有較大差異，香辣腐乳種優(yōu)勢(shì)真菌為曲霉屬（Aspergillus）、白菜腐乳優(yōu)勢(shì)真菌為畢赤酵母屬（Pichia）；同樣利用細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果表明，茨河腐乳中優(yōu)勢(shì)真菌為毛霉（Mucorspp.）、青霉（Penicilliumspp.）及紅酵母（Rhodotorulaspp.），而優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為假單胞菌屬[11]。周小虎等[12]擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)基因序列，研究白腐乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)微生物種群演替順序?yàn)槿闂U菌（Lactobacillus）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、明串珠菌（Leuconostoc）、四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）。由此可見(jiàn)，通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA/rDNA或是真菌ITS序列，再利用高通量測(cè)序平臺(tái)分析的方法途徑已較為成熟，通過(guò)該方法可明確腐乳發(fā)酵過(guò)程中微生物種群結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。

同樣，高通量測(cè)序技術(shù)也常應(yīng)用于白酒生產(chǎn)工藝發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。GUO等[13]通過(guò)提取微生物的宏基因組，利用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)分析白酒發(fā)酵窖池中微生物群落，結(jié)果表明，發(fā)酵窖池中優(yōu)勢(shì)微生物群落主要為L(zhǎng)actobacillus、Sedimentibacter、Syntrophomonas、Methanoculleus、Methanobacterium、Bacillus、Clostridium、Galactomyces、Candida、Pichia、Penicillium和Aspergillus。LI等[14]研究汾酒發(fā)酵劑生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)菌和真菌的多樣性，通過(guò)細(xì)菌16S rRNA基因、真菌ITS區(qū)的擴(kuò)增測(cè)序、分類和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多樣性遠(yuǎn)高于真菌，Pichia kudriavzevii為主要的真菌種群，而發(fā)酵劑表面的細(xì)菌種群主要為L(zhǎng)actobacillaceae family，在發(fā)酵劑表面內(nèi)部的主要細(xì)菌種群則為Bacillacae family。不僅如此，通過(guò)常規(guī)理化分析與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，還可以分析微生物種群與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝之間的關(guān)系。在某種調(diào)味白酒發(fā)酵過(guò)程中，淀粉和還原糖含量與醋酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、絲衣霉屬等呈正相關(guān)，與多臂菌屬、畢赤酵母屬等呈負(fù)相關(guān)；水分和酸度與乳桿菌、伊薩酵母屬、畢赤酵母屬等呈正相關(guān)，與醋酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、絲衣霉屬、紅曲菌屬等呈負(fù)相關(guān)[15]。

2.2 非發(fā)酵食品微生物檢測(cè)

高通量測(cè)序技術(shù)在非發(fā)酵食品的微生物相關(guān)領(lǐng)域也有諸多研究和應(yīng)用。丁君等[16]利用454焦磷酸測(cè)序平臺(tái)的研究表明，在外套膜的微生物種群豐度和多樣性上，缺刻蝦夷扇貝要高于健康蝦夷扇貝，且厚壁菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門等7個(gè)細(xì)菌門類在兩種蝦夷扇貝中均有分布。釀酒葡萄果皮表面的微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)直接影響葡萄酒發(fā)酵后的品質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)品種的釀酒葡萄果皮表面以芽孢桿菌屬、小雙孢菌屬（Microbispora）、歐文氏菌屬（Erwinia）、Kaistobacter、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，以耐冷酵母屬（Guehomyces）、黑附球菌屬（Epicoccum）、鏈格孢菌屬（Alternaria）、漆斑霉屬（Myrothecium）、枝孢屬（Cladosporium）、鐮孢屬（Fusarium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和孢霉屬（Mortierella）為優(yōu)勢(shì)真菌[17]。于國(guó)萍等[18]發(fā)現(xiàn)在原料乳中，乳球菌屬、芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）為優(yōu)勢(shì)微生物種群，并發(fā)現(xiàn)了志賀菌（Shigella）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）兩種致病菌。

2.3 食品微生物污染檢測(cè)

食源性致病菌嚴(yán)重危害人體健康，甚至是生命安全。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，可直接明確致病菌種類及來(lái)源等，從而做到有針對(duì)性的防護(hù)措施，杜絕致病菌對(duì)食品的污染。研究人員在某地區(qū)芫荽中檢測(cè)到腸胃炎、腹瀉的致病菌Escherichia coli、Bacteroides fragilis、Arcobacter butzleri、Providencia alcalifaciens，檢測(cè)到條件致病菌Moraxella osloensis、Acinetobacter radioresistens、Acinetobacter soli[19]。水源是微生物污染防治的重點(diǎn)，有研究表明，地表與地下來(lái)源的管網(wǎng)水中，微生物多樣性差異較大，且地表來(lái)源的更為豐富[20]。因此，先了解微生物種群結(jié)構(gòu)差異及來(lái)源，才能制定精準(zhǔn)的保護(hù)和治理方法。米粉、米線是生活中常食用的食品之一，其生產(chǎn)和儲(chǔ)存的環(huán)境條件都偏向于潮濕，更易于微生物的生長(zhǎng)和繁殖。有研究顯示，在米線原料和米線產(chǎn)品中都具有微生物的多樣性，并檢出了葡萄球菌屬、埃希氏桿菌屬和李斯特菌屬[21]。高通量測(cè)序能夠幫助研究食品中致病菌的存在，探明污染節(jié)點(diǎn)及原因，從而在各個(gè)環(huán)節(jié)中加以改善，讓食品變得更加安全和健康。

3 結(jié)語(yǔ)

食品微生物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用是食品工業(yè)中的一把雙刃劍，在豐富了發(fā)酵性食品種類及風(fēng)味的同時(shí)也帶來(lái)了食品安全風(fēng)險(xiǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)的問(wèn)世及其在食品微生物中的擴(kuò)展應(yīng)用，揭開(kāi)了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的神秘面紗，更有益于掌控在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)微生物多樣性的利用，從而開(kāi)發(fā)出更多滿足人們生活新需的食品種類。同時(shí)，由致病性微生物引發(fā)的食品安全問(wèn)題也變得可控，基于高通量測(cè)序技術(shù)，能夠明確致病性微生物的種群結(jié)構(gòu)，分析其在食品加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中的污染節(jié)點(diǎn)，可精準(zhǔn)地設(shè)計(jì)殺菌方式和環(huán)節(jié)條件，從源頭避免食品安全問(wèn)題的發(fā)生。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)不僅降低了檢測(cè)成本，也讓檢測(cè)結(jié)果變得更加精確。不僅如此，通過(guò)與Q-PCR芯片技術(shù)[22]、預(yù)測(cè)微生物學(xué)軟件[23]、廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)[24]等其他檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，可對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、安全等方面進(jìn)行更多元化的分析，真正實(shí)現(xiàn)吃得放心、吃得健康的目標(biāo)。