褪黑素處理對枸杞果實采后生理及貯藏品質(zhì)的影響

鄧淑芳，王鵬，張懷予，雷昊霖，崔美麗，馬文平, 王軍節(jié)*

1(植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室(北方民族大學)，寧夏 銀川，750021)2(北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川，750021)3(長沙理工大學 化學與食品工程學院，湖南 長沙，410114)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)為我國西北地區(qū)栽培的主要經(jīng)濟林作物，其果實富含多糖、類胡蘿卜素、多酚、黃酮和甜菜堿等天然活性成分而具有較高營養(yǎng)價值和保健功效，在國內(nèi)外藥食干制品市場享有盛譽[1]。研究表明，干燥過程易造成枸杞營養(yǎng)和功能成分損失[2]，加上人們對新鮮果品消費的追求，枸杞鮮果銷售的市場比例將日益增大。然而，枸杞漿果小而多汁，并且采收季節(jié)正值高溫，給鮮果枸杞采后貯運保鮮帶來挑戰(zhàn)[3]。因此，開展枸杞果實采后生理及貯藏保鮮技術(shù)研究具有重要意義。

褪黑素(melatonin，MT)又名N-乙酰-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，是一種吲哚類激素物質(zhì)，廣泛存在于動植物中[4]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素具有清除自由基、抗氧化、抗低溫脅迫、延緩植物衰老等功能，被認為是一種新的植物生理活動調(diào)節(jié)劑[5]，褪黑素還可應用于園藝作物成熟、衰老和貯藏保鮮的調(diào)控[6]。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素對不同種類果實作用方式不盡相同，例如，褪黑素一方面可以延緩梨[7]、獼猴桃[8]、石榴[9]、桃[10]、柑橘[11]和草莓[12]等果實的采后衰老，但另一方面褪黑素又可促進番茄[13]、杏[14]和葡萄[15]等果實的成熟。然而，有關(guān)褪黑素處理對枸杞果實衰老的研究鮮見報道。

本研究以“寧杞5號”鮮果為材料，通過不同濃度外源褪黑素處理，研究其對低溫貯藏期間枸杞果實生理指標和貯藏品質(zhì)的影響，并采用主成分分析法對果實貯藏品質(zhì)進行綜合評價，以期為褪黑素在枸杞果實采后貯運保鮮上的應用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試枸杞鮮果(LyciumbarbarumL.cv.Ningqi 5)采自寧夏農(nóng)林科學院枸杞研究所，采摘當天運達實驗室，挑選大小、色澤、果形和成熟度基本一致、無病蟲害、無機械傷的果實作為試驗材料。

UV-9000S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；H2100A型臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；SAM-706AC型水果糖度酸度測定儀，韓國G-WON公司；TMS-PRO型物性分析儀，美國FTC公司；PL2001-L型天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；HP-200型比色計，中國上海華科光電科技有限公司；7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 褪黑素處理枸杞果實

選取無病蟲害，大小一致的枸杞果實，用75%(體積分數(shù))乙醇擦拭果實表面消毒。將挑選的果實隨機分成4組，分別用0(對照)、25、50和75 μmol/L的褪黑素溶液浸泡5 min，每處理3次重復，然后在室溫下自然晾干，放入(4±0.5) ℃、(85±5)% 相對濕度(relative humidity，RH)的保鮮箱中[16]。每隔6 d測定果實的失重率、呼吸強度、乙烯、色澤、固酸比、硬度等指標。同時，在第0、6、12、18天進行果肉取樣，去除枸杞籽后，將枸杞果肉混均并用錫箔紙包裹，并立即用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存待測。每處理每個時間點取樣30包，每包3 g。

1.2.2 生理和品質(zhì)指標測定

1.2.2.1 呼吸強度和乙烯釋放速率

參照ZHANG等[17]的方法并作改進。稱取30粒果實，置于250 mL具塞玻璃瓶中，密封5 h。用氣體分析儀直接測定密閉環(huán)境中CO2濃度，并計算呼吸強度，以單位時間單位質(zhì)量果實釋放CO2的量表示，單位mg/(kg·h)。同時，從密閉容器中取出一定體積氣體，用氣相色譜法測定乙烯含量，以單位時間單位質(zhì)量果實釋放乙烯的量表示，單位μL/(kg·h)。

1.2.2.2 超氧陰離子含量

參照ZHANG等[18]方法并修改。取0.1 g果肉組織，加入1 mL pH 7.8的50 mmol/L磷酸提取緩沖液[內(nèi)含20 g/L 聚乙烯吡咯烷酮，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.3% (體積分數(shù))TritonX-100]后冰浴勻漿，隨后10 000×g、4 ℃離心20 min，取上清置于冰上待測。取待測液0.5 mL于試管中，加入0.4 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺溶液，混勻后于37 ℃水浴20 min。加入17 mmol/L 4-氨基苯磺酸和7 mmol/L的α-萘胺各0.3 mL，混勻后，37 ℃，20 min。加入氯仿0.5 mL，混勻，8 000×g、25 ℃離心5 min，小心吸取上層水相1.0 mL于530 nm測定吸光度值。超氧陰離子含量表示為每克鮮重果肉的超氧陰離子含量，即為nmol/g。每處理樣品重復測定3次。

1.2.2.3 過氧化氫含量

參照WANG等[19]方法并修改。取0.02 g枸杞組織樣品，加入0.2 mL 2 g/L三氯乙酸勻漿，4 ℃、12 000×g離心5 min后取上清液待測。取0.1 mL待測液于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL 1 mol/L碘化鉀溶液，輕輕混勻后于室溫(25±3) ℃下放置30 min，然后測定反應體系在560 nm處的吸光度。過氧化氫含量表示為每克鮮重果肉的超氧陰離子含量，即為nmol/g。每處理樣品重復測定3次。

1.2.2.4 色澤

在貯藏的第0、6、12、18天，使用校準的比色計對每個果實赤道部位的對稱兩面測量果皮顏色的a*、b*、L*、C*和H*值。其中，a*值表示呈色物質(zhì)的綠色(-)到紅色(+)偏向，b*值表示是藍色(-)到黃色(+)偏向；L*代表亮度，數(shù)值范圍從0(黑色)到100(白色)；飽和度C*=(a*2+b*2)1/2；色調(diào)角H*=arctan(b*/a*)[17]。

1.2.2.5 硬度

用質(zhì)構(gòu)儀測定果皮硬度[17]。使用直徑為2 mm的圓柱形探針進行硬度測量，參數(shù)如下：測試前速度100 mm/min，測試速度30 mm/min，測試后速度100 mm/min，穿透距離5 mm，觸發(fā)力0.05 N。每處理樣品重復評估6個水果。

1.2.2.6 固酸比

用水果糖度酸度測定儀進行測定果實糖度(%)和酸度(%)，并計算固酸比。

1.2.2.7 總酚和總黃酮含量

參照ZHANG等[17]的方法并作改進。用無水乙醇通過超聲提取法提取總酚，將1 mL提取液與等體積福林酚試劑(1∶10，體積比)和1.5 mL 75 g/L 的Na2CO3溶液混合，然后在室溫下避光孵育3 h。在765 nm測定吸光度，結(jié)果以mg/100g FW表示。每處理重復測定3次。

總黃酮含量的測定[20]：將0.5 mL上述總酚提取液與20%(體積分數(shù))HCL溶液0.5 mL混合，再與37%(體積分數(shù))甲醛溶液0.25 mL混合，并于室溫下避光靜置24 h。使用濾紙過濾反應溶液后，采用上述福林酚法測定濾液中非黃酮類化合物的含量。最后從總酚含量中減去總非黃酮類含量來計算總黃酮含量，結(jié)果以mg/100g FW表示。每處理重復測定3次。

1.2.2.8 類胡蘿卜素含量

參照熱合曼等[21]方法并修改。標準曲線制作：精密稱取β-胡蘿卜素標準品4 mg，用少量二氯甲烷溶解后， 石油醚-丙酮(4∶1，體積比)定容于50 mL棕色容量瓶中，分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL 至10 mL棕色容量瓶中，用石油醚-丙酮(4∶1，體積比)定容，在448 nm處測定其吸光度，制作標準曲線。

樣品測定：稱取枸杞1.000 0 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶15(g∶mL)加15 mLV(石油醚)∶V(丙酮)=4∶1的混合溶液，室溫條件下超聲提取3次，每次20 min，過濾合并濾液，濾渣洗滌數(shù)次至濾液無色為止，定容至250 mL棕色容量瓶中，于448 nm處測定其吸光度，并按標準曲線方程算出相應的類胡蘿卜素含量。類胡蘿卜素含量以%表示，每處理重復測定3次。整個實驗需在避光下進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 5.0計算平均值、標準偏差并繪制圖表；采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Duncan′s檢驗進行差異顯著性分析(P<0.05為差異顯著)；采用XLSTAT 2016 對數(shù)據(jù)進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素處理對枸杞果實采后生理指標的影響

2.1.1 對呼吸強度和乙烯釋放速率的影響

褪黑素處理對枸杞果實呼吸強度的影響如圖1-A所示。貯藏期間各組果實的呼吸強度均呈現(xiàn)先上升后下降的單峰形變化趨勢，在第12天時達到峰值，對照組呼吸峰值最大。貯藏第18天時，對照組果實的呼吸強度高達18.49 mg/(kg·h)，同期25、50和75 μmol/L褪黑素處理組果實的呼吸強度分別比對照組低7.87、10.18、和9.01 mg/(kg·h)。其中，50 μmol/L褪黑素處理組果實的呼吸強度在整個貯藏期始終處于最低水平。

如圖1-B所示，不同時間點不同濃度褪黑素處理對枸杞果實乙烯釋放速率的影響不同。隨貯藏時間的延長，果實的乙烯釋放速率呈現(xiàn)出下降后上升最后又下降的趨勢，乙烯釋放速率在第12天時達到峰值。第18天時，各濃度褪黑素處理組果實的乙烯釋放速率均低于對照組[0.62 mg/(kg·h)]，而50 μmol/L褪黑素處理組果實的乙烯釋放速率最低。

A-枸杞果實呼吸強度；B-乙烯釋放速率圖1 褪黑素處理對枸杞果實呼吸強度和乙烯釋放速率的影響Fig.1 Effect of melatonin treatment on respiratory intensity and ethylene release rate of goji berry

2.1.2 對超氧陰離子和過氧化氫含量的影響

不同時間點不同濃度褪黑素處理對枸杞果實超氧陰離子含量的影響不同(圖2-A)。枸杞果實中的超氧陰離子含量隨著貯藏時間的延長而逐漸增加，在第18天時含量最高。貯藏第12天時，25、50和75 μmol/L 褪黑素處理果實的超氧陰離子含量分別為118.56、108.91和100.52 nmol/g，比同期對照(125.51 nmol/g)低5.54%、13.23%和19.91%。

由圖2-B可以看出，各組枸杞果實中過氧化氫含量的變化趨勢基本一致，整體呈先上升后下降的趨勢。貯藏第12 d時，25、50和75 μmol/L褪黑素處理組比同期對照組(4 245.32 nmol/g)分別低22.11%、26.07%、6.57%。在第18天時，褪黑素處理組果實的過氧化氫積累量仍低于對照組。

A-超氧陰離子；B-過氧化氫圖2 褪黑素處理對枸杞果實超氧陰離子和過氧化氫含量的影響Fig.2 Effect of melatonin treatment on the content of superoxide anion and hydrogen peroxide in goji berry

2.2 褪黑素處理對枸杞果實貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1 褪黑素處理對枸杞果實品質(zhì)指標的影響

褪黑素處理對枸杞果實色澤、硬度、固酸比、總酚、類黃酮、類胡蘿卜素等品質(zhì)指標的影響結(jié)果如表1所示。在貯藏期間，各組枸杞果實L*、a*、b*、C*、H*值總體呈下降趨勢。在貯藏第6天時，各組a*、b*、H*值均無顯著差異(P<0.05)，而在貯藏第12天時，50 μmol/L處理組的a*和C*值均顯著高于(P<0.05)同期對照組；在貯藏第18天時，25和50 μmol/L處理組的a*、b*和C*值均比同期對照組高(P<0.05)。

表1 褪黑素處理對枸杞果實品質(zhì)指標的影響Table 1 Effect of melatonin treatment on fruit quality index of goji berry

在貯藏期間，隨著時間的延長，枸杞果實的硬度和固酸比總體呈逐漸下降的趨勢。貯藏第18天時，25、50和75 μmol/L褪黑素處理果實的硬度均顯著高于(P<0.05)同期對照，分別是對照的1.10、1.09、1.08倍。在貯藏期間，50和75 μmol/L處理組的固酸比始終高于對照組(P<0.05)。

枸杞果實在貯藏期間的總酚及類黃酮含量總體均呈上升趨勢，對照組的總酚及類黃酮含量始終處于較低水平。貯藏第12天時，對照組總酚含量達到峰值250.89 mg GAE/100g，同期50和75 μmol/L褪黑素處理組總酚含量分別為對照組的1.23和1.36倍，且與對照組存在顯著性差異(P<0.05)。果實的類黃酮含量在貯藏第12天達到峰值199.27 mg GAE/100g，同期50和75 μmol/L褪黑素處理組的類黃酮含量顯著高于(P<0.05)對照組，分別比對照組高出30.75%和44.05%。第18天時，50和75 μmol/L褪黑素處理組總酚及類黃酮含量仍顯著高于(P<0.05)同期對照組。

類胡蘿卜素含量在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢，且各處理組類胡蘿卜素含量在12和18 d時均顯著高于(P<0.05)對照組；第18天時，50 μmol/L的類胡蘿卜素含量最高，為對照組的1.69倍。

2.2.2 枸杞果實貯藏期間品質(zhì)的主成分分析

研究首先開展了Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)檢驗和Bartlett′s球形檢驗，結(jié)果顯示，KMO統(tǒng)計量為0.669，Bartlett球形度檢驗P(Sig.)<0.000 1，各變量之間存在顯著相關(guān)性，適合進行主成分分析。通過主成分分析得出各主成分的特征值、方差貢獻率、累積方差貢獻率(表2)。由表2可知，前2個主成分的特征值均大于1，累積方差貢獻率達到85.74%，說明前2個主成分反映了原始變量的絕大部分信息，符合分析要求。因此取前2個主成分做二維得分雙標圖(圖3)與散點圖(圖4)，研究所選變量與因子之間的相關(guān)性，從中分析可能得到信息。

表2 七個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累計貢獻率Table 2 The eigenvector, eigenvalue, account and total account of 7 principal components

圖3 枸杞果實貯藏品質(zhì)主成分分析雙標圖Fig.3 Double plot of scores for principal component analysis of storage quality in goji berry

圖4 枸杞果實貯藏品質(zhì)主成分分析散點圖Fig.4 Distribution point diagram of principal component analysis of storage quality in goji berry

由圖3可知，主成分F1與L*、a*、b*、硬度及固酸比呈正相關(guān)，而與總酚含量、類黃酮含量呈負相關(guān)。結(jié)合圖3、圖4數(shù)據(jù)的分布情況可知，主成分F1可根據(jù)貯藏時間區(qū)分不同處理枸杞果實品質(zhì)，即較長的貯藏時間對應于較差的品質(zhì)指標。0～0、0～25、0～50及0～75 μmol/L位于雙標圖的右上象限，其特征是對應較高L*、a*、b*、硬度及固酸比。隨貯藏時間的延長，在第6天時，各組均由右半?yún)^(qū)向左半?yún)^(qū)移動，枸杞果實的色澤、硬度和固酸比開始下降。在第12天時，褪黑素處理組(12～50、12～75 μmol/L)的枸杞果實的因子得分位于左上象限，對應較高的總酚及類黃酮含量；相比之下，對照組(12～0 μmol/L)位于負坐標處，表明其總酚和類黃酮的積累量較低，且色澤品質(zhì)較差。貯藏結(jié)束時，各組都已從右半?yún)^(qū)移至左半?yún)^(qū)，果實色澤逐漸變得暗黃，果肉開始變軟，品質(zhì)逐漸下降。此時，對照組(18～0 μmol/L)處于左下象限，果實內(nèi)總酚及類黃酮含量較少，枸杞的色澤、質(zhì)地較差，貯藏品質(zhì)不佳。與此相反，褪黑素處理組(18～25、18～50、18～75 μmol/L)均處于左上象限，枸杞果實內(nèi)總酚和類黃酮的積累量較高，有效延緩了枸杞果實衰老，使枸杞品質(zhì)得以較好地保持。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，枸杞果實貯藏期間，生理活動活躍，品質(zhì)發(fā)生劣變，表現(xiàn)為果實呼吸強度和乙烯釋放速率升高，色澤、硬度和固酸比下降；褪黑素處理有效延緩了枸杞果實貯藏前期果實色澤、硬度和固酸比等品質(zhì)指標的下降，抑制呼吸強度升高，保持了較好的果實品質(zhì)。但在貯藏后期對其品質(zhì)影響不大，這可能是由于枸杞果實進入衰老期，活性氧代謝紊亂造成果實品質(zhì)發(fā)生劣變。這與GAO等[10]和AGHDAM等[12]報道結(jié)果類似。此外，從品質(zhì)指標測定結(jié)果可以看出貯藏末期果實品質(zhì)是遠遠低于貯藏初期，這與李玉等[22]的報道結(jié)果類似。

在貯藏過程中，果實體內(nèi)活性氧會不斷積累，主要體現(xiàn)在超氧陰離子含量和過氧化氫含量的升高，這使得細胞出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象，導致細胞膜的退化，從而加速其衰老進程[23]。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)褪黑素處理后，枸杞果實中超氧陰離子的積累量在短期增加后持續(xù)下降，且顯著低于(P<0.05)對照組；貯藏后期，50 μmol/L褪黑素處理組效果最佳。這可能是由于褪黑素作為抗氧化劑，直接消除活性氧，激活抗氧化系統(tǒng)，提高其他抗氧化劑的效率，從而延緩枸杞果實的衰老[24]。第6天時，褪黑素處理組果實中出現(xiàn)了較高水平的過氧化氫含量，且各處理組均高于對照組。這與SHARAFI等[25]的研究結(jié)果相符，可能是由于過氧化氫作為信號促進內(nèi)源褪黑素和γ-氨基丁酸的生物合成，從而有利于枸杞果實在冷藏過程中緩解應激，延緩衰老，保持感官和營養(yǎng)品質(zhì)。然而貯藏6 d之后，經(jīng)25和50 μmol/L褪黑素處理的枸杞果實內(nèi)過氧化氫的積累量持續(xù)降低，表明褪黑素處理改善了枸杞果實中氧化應激，這可能是由于內(nèi)源褪黑素積累表現(xiàn)出優(yōu)越的活性氧清除特性[26]。酚類物質(zhì)是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，有很強的清除自由基和抗氧化的能力[27]；50 μmol/L褪黑素處理組在整個貯藏期保持較高總酚含量，延緩果實衰老的進程，延長貯藏期限。類黃酮則是重要的植保素，與果實抗氧化活性密切相關(guān)[28]，褪黑素處理使果實保持較高類黃酮含量，維持了枸杞鮮果的抗氧化活性與營養(yǎng)品質(zhì)。類胡蘿卜素是枸杞的一類主要特征性功效成分，具有較高營養(yǎng)價值；50 μmol/L褪黑素處理可以減緩類胡蘿卜素分解，使枸杞果實的營養(yǎng)品質(zhì)得以較好保持，這一結(jié)果在MARCHETTI等[29]的研究中也被證實。

主成分分析法是利用降維的思維，運用線性變化將多個變量簡化成少數(shù)綜合變量的一種統(tǒng)計分析方法。這些綜合指標能保留原有指標的大部分信息，且相互獨立，避免了重復信息的干擾，分析結(jié)果更加合理，同時具有較強代表性，增加了可信度[30]。為避免單一品質(zhì)指標分析的片面性，本研究通過主成分分析法對枸杞果實采后各品質(zhì)指標進行了綜合性評價。評價結(jié)果表明，L*、a*、b*、總酚含量、類黃酮含量、硬度及固酸比所代表的2個主成分可以客觀地反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息，顯示了貯藏期間枸杞果實綜合品質(zhì)的動態(tài)變化；隨著貯藏時間的延長，枸杞果實綜合品質(zhì)逐漸下降，而褪黑素處理在果實貯藏期間能減緩枸杞果實品質(zhì)下降，延長果實的貯藏期限。

綜上所述，外源褪黑素處理能夠抑制枸杞鮮果采后呼吸強度和乙烯釋放速率，清除果實體內(nèi)的活性氧，有效保持果實色澤、硬度、固酸比、總酚含量、類黃酮含量和類胡蘿卜素含量，從而延緩低溫貯藏期間枸杞鮮果品質(zhì)的下降，在枸杞果實采后貯運保鮮中具有潛在的應用前景。