黃刺漿果不同組分多糖理化性質(zhì)及生物活性的比較

周雯，韓麗娟,2*，馬娜娜，漆瑩，岳慶明，索南卓瑪，郭妍，院珍珍,2

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧，810016)

直穗小檗(BerberidasystachyaM.)，小檗科，小檗屬，落葉灌木[1]，因其黃色莖和根而被稱為“黃刺”，在青海省分布廣，資源豐富[2]，是青藏高原一種重要的藥食同源漿果資源。其果實中富含多糖、植物甾醇、有機酸、多酚等多種活性物質(zhì)[3]，課題組前期研究表明，黃刺果粉能通過緩解氧化應(yīng)激來改善胰島β細(xì)胞損傷，達(dá)到降血糖的目的[4]?；钚远嗵鞘瞧渲饕πС煞种?，據(jù)報道，黃刺多糖具有較強的降血糖[5]、抗氧化、抗腫瘤增殖[5]等有益的生物學(xué)功能，極具開發(fā)價值。

腸道消化酶抑制劑可有效降低餐后血糖水平，然而國內(nèi)外有關(guān)黃刺多糖對糖苷酶活性的抑制作用尚未見報道。氧化應(yīng)激是糖尿病發(fā)病因素之一，相關(guān)研究表明自由基過量引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生多余的活性氧，進(jìn)而氧化和攻擊DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，損傷胰島β細(xì)胞[6]，因此可通過清除自由基體系評價多糖的體外抗氧化活性。多糖的降血糖機制與體內(nèi)的消化代謝過程關(guān)系密切[7]，即通過調(diào)節(jié)腸道微生物組成比例提高有益的短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)含量，多種腸道細(xì)菌對單糖、雙糖及多糖具有酵解作用，由腸道微生物群酵解的多糖的主要代謝物是SCFA：乙酸、丙酸和丁酸，其在體內(nèi)發(fā)揮重要的作用[8]，乙酸可以降低餐后血糖和胰島素抵抗；丙酸是糖異生的主要前體物；丁酸作為結(jié)腸上皮細(xì)胞重要的能量來源，能修復(fù)細(xì)胞損傷、維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。SCFA具有調(diào)節(jié)血糖、改善腸道菌群平衡等作用[9-10]。嗜酸乳桿菌和大腸桿菌分別作為腸道優(yōu)勢益生菌和致病菌，通過炎癥反應(yīng)、SCFA等多種途徑參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展[11]。因此綜合探討體外抗氧化、降血糖及多糖體外消化酵解對腸道菌群的影響可以更全面地探討黃刺多糖的降血糖活性。

多糖的生物活性與分子質(zhì)量、單糖組成等密切相關(guān)，不同組分多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性具有一定差異[12]，如ZOU等[13]發(fā)現(xiàn)80%乙醇醇沉得到的多糖的抗氧化和抗癌細(xì)胞增殖效果最優(yōu)，對扁豆多糖[14]的研究發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%和70%時多糖結(jié)合膽汁酸的能力最強，適于降低血脂。因此，本文以黃刺漿果為原料，分級醇沉提取3種不同分子質(zhì)量的活性多糖組分，比較體外抗氧化和降血糖功效，利用體外細(xì)菌培養(yǎng)條件單一的優(yōu)勢，基于腸道微生物菌群角度研究糖尿病治療及作用機制，為將黃刺多糖研制成高效無毒的天然降血糖醫(yī)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃刺，采摘自青海省大通縣；大腸桿菌菌粉，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；嗜酸乳桿菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；抗壞血酸、DPPH、ABTS、α-葡萄糖苷酶，南京都萊生物技術(shù)有限公司；α-淀粉酶、對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, PNPG)，北京索萊寶生物科技有限公司；阿卡波糖，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

GS55-9冷凍干燥機、ND-One全波長超微量分光光度計，基因有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計、LC-10A高效液相色譜儀，島津有限公司；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠；SB-3200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；S-100傅里葉變換紅外光譜儀，珀金埃爾默儀器有限公司；SU8220冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；SPX-250F生化培養(yǎng)箱，寧波特朗普儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YM-75立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；7890A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同組分黃刺多糖的制備

工藝流程：

黃刺干果→粉碎過篩→95%乙醇浸泡過夜(脫脂)→超聲輔助熱水浸提殘渣(重復(fù)3次)→濾液濃縮至1/4→Sevage法除蛋白→D101大孔樹脂脫色→透析(除小分子物質(zhì))→醇沉→冷凍干燥→黃刺粗多糖BDPs

將10 g的BDPs溶于100 mL超純水，4 500 r/min離心10 min，在上清液中加入無水乙醇使得乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，醇沉24 h，4 500 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到多糖樣品BDPs-70，上清液中繼續(xù)添加無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，重復(fù)上述操作分別得到BDPs-80和BDPs-90[12]。

1.2.2 不同組分BDPs得率的計算

將1.2.1中得到的3個組分多糖稱重，得率計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.3 不同組分BDPs的化學(xué)組成

多糖含量測定采用苯酚硫酸法[15]，根據(jù)回歸方程y=13.782x-0.000 4(R2=0.999 3)計算；蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[9]，根據(jù)回歸方程y=8.400 4x-0.010 6(R2=0.999 4)計算；糖醛酸含量測定采用硫酸-咔唑法[11]，根據(jù)回歸方程y=3.779 6x+0.003 2(R2=0.999 0)計算。

1.2.4 不同組分BDPs的初步結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)表征不同組分BDPs的分子質(zhì)量

(1)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，樣品配制成5 mg/mL溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣小瓶中。

(2)色譜條件：色譜柱為BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱(8 mm×300 mm)；流動相：0.05 mmol/L NaCl溶液；流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；示差檢測器RI-10A[16]。

1.2.4.2 傅里葉紅外光譜(Fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)分析

分別取2 mg不同組分BDPs粉末與100 mg無水KBr均勻混合，研磨壓片，在FT-IR儀上于4 000～400 cm-1掃描[17]。

1.2.4.3 掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)

在基板上放置帶有薄金層的樣品涂層，1.0 kV電壓下觀察樣品形貌[18]。

1.2.5 不同組分BDPs的體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[19]并稍作修改，2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(乙醇配制)與2 mL樣品(0.5、1、2、4、8、16 mg/mL)均勻混合，置于室溫下反應(yīng)30 min，于517 nm處檢測其吸光值。DPPH自由基清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為DPPH溶液加無水乙醇的吸光值；A2為DPPH溶液中加樣品反應(yīng)后的吸光值。

1.2.5.2 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[20]，將7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀均勻混合，放置于黑暗陰涼處16 h；而后用PBS溶液(pH=7.0)稀釋混合液至其吸光值在734 nm處為0.70±0.02；樣品(0.5、1、2、4、8、16 mg/mL)與ABTS混合溶液比例為1∶20，混合后于室溫下孵育6 min，于734 nm處測定吸光值。ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A1為ABTS混合溶液加超純水的吸光值；A2為ABTS混合溶液中加樣品后測的吸光值。

1.2.5.3 還原力測定

參考文獻(xiàn)[21]并稍作修改，1 mL樣品(0.5、1、2、4、8、16 mg/mL)中加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L、pH 6.6)和鐵氰化鉀溶液，均勻混合后50 ℃反應(yīng)20 min，加入1 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，冷卻至室溫，加入1 mL 1 g/L的三氯化鐵溶液，靜置10 min，700 nm處測定吸光值。

1.2.6 不同組分BDPs的體外降血糖活性測定

1.2.6.1 α-葡萄糖苷酶抑制率測定

參考文獻(xiàn)[22]，將不同組分黃刺多糖用磷酸緩沖液(pH=6.8)稀釋至不同質(zhì)量濃度(16、8、4、2、1、0.5 mg/mL)，在96孔板中依次加90 μL樣品、20 μL 2 U/mL α-葡萄糖苷酶，37 ℃反應(yīng)5 min，加入50 μL 10 mmol/L PNPG，37 ℃反應(yīng)10 min后于405 nm處測定吸光值，抑制率計算如公式(4)所示：

(4)

式中：A1、A2、A3和A4分別為樣品組、樣品空白組，陰性對照組和空白組的吸光值。

1.2.6.2 α-淀粉酶抑制率測定

參考文獻(xiàn)[22]，0.5 mL凍存管中依次加入25 μL樣品(同1.2.6.1)、25 μL 15 U/mL α-淀粉酶溶液，37 ℃ 水浴10 min，加入25 μL 10 mg/mL淀粉溶液，37 ℃反應(yīng)10 min后加入125 μL DNS試劑，沸水浴反應(yīng)5 min，迅速冷卻至室溫，540 nm處測定吸光值。

(5)

式中：A1、A2、A3和A4分別為樣品組、樣品空白組，陰性對照組和空白組的吸光值。

1.2.7 菌種的活化及菌懸液制備

用無菌接種環(huán)接種嗜酸乳桿菌(大腸桿菌)于MRS(LB)固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，無菌生理鹽水稀釋已活化的菌懸液，制備104～105CFU/mL菌懸液待用[23]。

1.2.8 不同組分BDPs的酵解和菌種生長速率的測定

取0.1 mL不同質(zhì)量濃度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL)的多糖液加入到無菌MRS(LB)固體培養(yǎng)基中，0.1 mL無菌水作對照，再吸取0.1 mL的嗜酸乳桿菌(大腸桿菌)菌液加入到培養(yǎng)基中涂布均勻，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)，觀察數(shù)據(jù)得多糖的增殖或抑制效果[24]。

取100 μL的MRS(LB)肉湯于96孔板中，加入25 μL的嗜酸乳桿菌(大腸桿菌)菌液(0.5 mg/mL)，最后加入75 μL的不同組分BDPs溶液，不加多糖溶液的一組作為對照組。放入生長曲線機中測繪24 h(45 h)的生長曲線。

1.2.9 SCFA含量的測定

(1)色譜及質(zhì)譜條件：色譜柱為DB-WAX(60 m×0.25 mm,0.5 μm)；進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為N2，進(jìn)樣量3 μL；柱升溫程序為初始溫度70 ℃，以10 ℃/min升溫至200 ℃，然后以30 ℃/min升溫至240 ℃并保持3 min，分流比20∶1；柱流量1 mL/min，20PSI恒壓模式；EI離子源溫度230 ℃。

(2)SCFA的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸配制成一系列不同質(zhì)量濃度梯度(0.1～5.0 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾并按濃度梯度進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到各種短鏈脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乙酸：y=26.78x+1.542(R2=0.999 2)

丙酸：y=34.15x+2.506(R2=0.999 4)

異丁酸：y=12.46x+2.097(R2=0.998 3)

正丁酸：y=33.446x+4.598(R2=0.999 6)

(3)樣品前處理：稱取0.2 g培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)基于無菌離心管內(nèi)，加入1 mL甲醇靜置10 min，振蕩混勻成懸液。再用濃硫酸調(diào)節(jié)pH 2～3，靜置5 min，離心(1 000 r/min，10 min)吸取上清液，過0.22 μm有機濾膜，檢測SCFA含量[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示；使用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著,Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組分BDPs的得率及化學(xué)組成分析

由表1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，多糖得率越高，說明沉淀出來的多糖的種類隨著乙醇濃度的升高而增多，多糖和糖醛酸含量依次為BDPs-80>BDPs-90>BDPs-70，且差異顯著(P<0.05)；蛋白質(zhì)含量均較低，說明提取及精制過程中蛋白基本被脫除。造成BDPs-90的多糖和蛋白含量減少的原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，某些多糖分子與蛋白相結(jié)合形成糖蛋白，并溶解到乙醇中[25]。

表1 不同組分BDPs的得率及化學(xué)成分 單位：%

2.1.1 不同組分BDPs分子質(zhì)量分布

采用HPGPC測定BDPs-70、BDPs-80、BDPs-90的分子質(zhì)量，根據(jù)GPC軟件擬合出的標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線lgMw=-0.181 7tR+11.888(tR為保留時間Mw為重均分子質(zhì)量)，R2=0.987 6，計算出每個樣品的分子質(zhì)量大小，結(jié)果見圖1。各組分的保留時間、Mw及多分散性相對含量見表2。由圖1和表2可知，BDPs-70、BDPs-80、BDPs-90的保留時間分別為43.225、43.213、43.224 min，Mw分別為9 851、9 901、9 855 Da，表明分級醇沉可以得到分子質(zhì)量不同的多糖，隨著乙醇濃度的增大，部分低濃度難以沉淀的大分子多糖逐漸沉淀，而乙醇濃度進(jìn)一步增大時，有利于小分子多糖的沉淀[13]，從而導(dǎo)致分子質(zhì)量先增后減，BDPs-90中可能存在較多低分子質(zhì)量多糖；多分散指數(shù)分別為1.21、1.20、1.20，接近于1，說明分子質(zhì)量分布均一且均在可接受范圍。

a-BDPs-70；b-BDPs-80；c-BDPs-90圖1 不同組分BDPs的HPGPC譜圖Fig.1 High performance gel permeation chromatography of BDPs with different components注：46.8 min左右為流動相的峰

表2 不同組分BDPs分子質(zhì)量分布表Table 2 Molecular weight distribution table of BDPs of different components

2.1.2 紅外光譜分析

FT-IR用于研究碳水化合物，因為其能夠識別植物多糖的官能團，由圖2可知，不同濃度乙醇醇沉的BDPs組分具有相同的特征，均具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰。其中3 421 cm-1處附近出現(xiàn)的強吸收峰為糖類—OH的伸縮振動峰，說明不同組分BDPs均存在分子間氫鍵。2 927 cm-1附近的吸收峰是C—H的伸縮振動引起的，羰基在1 608 cm-1處有強吸收峰。1 403 cm-1處的吸收為羧基的對稱伸縮振動，提示結(jié)構(gòu)中可能存在糖醛酸，與糖醛酸含量測定一致。1 085 cm-1處的吸收峰表明不同組分BDPs的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型。879 cm-1附近的吸收峰為β-糖苷的特征吸收峰[26-27]。由此可推測不同組分BDPs結(jié)構(gòu)相似，均為β-吡喃型多糖。

圖2 不同組分BDPs的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of BDPs with different components

2.1.3 SEM分析

由圖3可觀察到3個組分的BDPs均由片狀體為主，比較粗糙，形貌有一定差異性，如緊密程度不同，可能是由于多糖醇沉過程中乙醇濃度不同引起不一樣的超微結(jié)構(gòu)。BDPs-70由部分致密膜狀物和堆積的較松散的片狀組成。BDPs-80片層完整，質(zhì)地緊致。BDPs-90片層瓦解，表面較多孔洞，粗糙且松散。

a-BDPs-70；b-BDPs-80；c-BDPs-90圖3 不同組分BDPs的SEM圖Fig.3 SEM of BDPs with different components

2.2 不同組分BDPs的體外抗氧化活性分析

活性氧，如DPPH、ABTS陽離子自由基是生物體通過多種方式產(chǎn)生的，過量的活性氧危害大，毒性強，易導(dǎo)致胰島β細(xì)胞氧化損傷[4]，為有效預(yù)防和控制過量的自由基引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過測定天然產(chǎn)物對自由基的清除作用評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性[28]。

2.2.1 清除DPPH自由基活性

不同組分BDPs對DPPH自由基的清除率如圖4-a所示，在實驗質(zhì)量濃度0.5～16 mg/mL內(nèi)呈劑量依賴型，但一直低于維生素C的清除效果(P<0.01)。16 mg/mL時，清除率BDPs-90略高于BDPs-80(P>0.05)，均顯著高于BDPs-70(P<0.05)。半抑制濃度(IC50)依次為：5.174 mg/mL(BDPs-90)<7.031 mg/mL(BDPs-80)<7.187 mg/mL(BDPs-70)，綜合最大清除率和IC50可發(fā)現(xiàn)，BDPs-90清除DPPH自由基的效果最好的，這可能與多糖分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)及單糖組成有關(guān)。

2.2.2 清除ABTS陽離子自由基活性

如圖4-b所示，不同組分BDPs對ABTS陽離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，多糖質(zhì)量濃度16 mg/mL時，清除率均接近于維生素C(P<0.01)，且BDPs-90>BDPs-80>BDPs-70，差異不顯著(P>0.05)，IC50依次為：5.186 mg/mL(BDPs-80)<5.689 mg/mL(BDPs-90)<8.478 mg/mL(BDPs-70)，BDPs-80和BDPs-90 對ABTS陽離子自由基的清除活性無顯著差異。在同一測試濃度下，對DPPH自由基清除率高于ABTS陽離子自由基，這種差異可能是由于自由基的清除機制不同。

a-清除DPPH自由基能力；b-清除ABTS陽離子自由基能力；c-還原力圖4 不同組分BDPs體外抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of different components of BDPs in vitro

2.2.3 還原力

抗氧化劑清除自由基主要通過自身還原作用，吸光值越大，還原力越高[29]。由圖4-c可知，不同組分BDPs還原力大小與多糖質(zhì)量濃度呈明顯的劑量依賴性，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到16 mg/mL時，不同組分BDPs還原能力均達(dá)到最大，BDPs-80的OD700高達(dá)0.960 027，盡管低于維生素C(P<0.01)，但也呈現(xiàn)出較好的還原能力。

2.3 不同組分BDPs的體外降血糖活性分析

碳水化合物(如淀粉等)在體內(nèi)先被α-淀粉酶水解為麥芽糖、α-糊精等，再與蔗糖共同被α-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖、果糖等，被小腸吸收[30]，抑制消化酶活性可降低餐后血糖。

2.3.1 不同組分BDPs對α-淀粉酶的抑制率

如圖5-a所示，不同組分BDPs對α-淀粉酶的抑制率與濃度呈正相關(guān)，多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，抑制率均高于50%，展現(xiàn)出較好的降血糖活性。多糖質(zhì)量濃度為16 mg/mL時，抑制率依次為：BDPs-90(73.72%)>BDPs-80(73.10%)>BDPs-70(71.21%)，無顯著差異，但均低于阿卡波糖(P<0.01)。由于提取的BDPs均未純化，經(jīng)純化后抑制率是否會高于阿卡波糖有待深入研究。

a-對α-淀粉酶的抑制率；b-對α-葡萄糖苷酶的抑制率圖5 不同組分BDPs體外降血糖活性Fig.5 Hypoglycemic activity of different components of BDPs in vitro

2.3.2 不同組分BDPs對α-葡萄糖苷酶的抑制率

如圖5-b所示，不同組分BDPs對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增大，均具有一定的降血糖活性，多糖質(zhì)量濃度為16 mg/mL時，BDPs-80的抑制率稍高于BDPs-90，差異不顯著，但均顯著高于BDPs-70(P<0.01)。IC50依次為：17.038 mg/mL(BDPs-80)<18.745 mg/mL(BDPs-90)<26.789 mg/mL(BDPs-70)。由此可看出BDPs-80和BDPs-90的降血糖活性優(yōu)于BDPs-70。

2.4 不同組分BDPs對腸道微生物體外增殖作用的影響

腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)與糖尿病密切聯(lián)系，大腸桿菌屬、腸球菌屬等致病菌的含量與炎性細(xì)胞因子呈正相關(guān)，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等有益菌的含量與之呈負(fù)相關(guān)[31]。

由圖6-a可看出，將不同組分BDPs作為特定的生長因子添加到嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)基中，與空白對照相比，發(fā)現(xiàn)多糖對嗜酸乳桿菌有明顯的增殖效果，但無劑量依賴性。BDPs-90在實驗濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)較好的增殖效果。

由圖6-b可知，將不同組分BDPs作為特定的生長因子添加到大腸桿菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，BDPs-80組分與對照組相比呈現(xiàn)極顯著抑制效果，且不同組分BDPs對大腸桿菌均有一定的抑制能力。

a-嗜酸乳桿菌；b-大腸桿菌圖6 不同組分BDPs對細(xì)菌體外增殖作用的影響Fig.6 The effects of different components of BDPs on the proliferation of bacteria

2.5 嗜酸乳桿菌及大腸桿菌生長速率的分析

由圖7-a可知，加入不同組分BDPs對嗜酸乳桿菌有增殖作用，隨著培養(yǎng)時間的延長，其吸光值也會有相應(yīng)的增長，說明嗜酸乳桿菌可以利用不同組分的BDPs并促進(jìn)其自身的生長，在培養(yǎng)的24 h內(nèi)BDPs-70與BDPs-90的促增殖效果優(yōu)于BDPs-80。

由圖7-b可看出，培養(yǎng)時間在0～35 h，不同組分BDPs對大腸桿菌的抑制作用并不明顯，隨著培養(yǎng)時間的延長，BDPs-90和BDPs-80對大腸桿菌生長開始產(chǎn)生抑制作用，BDPs-70對大腸桿菌的抑制效果在41 h之后才體現(xiàn)出來。

a-嗜酸乳桿菌；b-大腸桿菌圖7 不同組分BDPs對細(xì)菌生長曲線的影響Fig.7 Effects of different components of BDPs on the growth curves of bacteria

2.6 短鏈脂肪酸含量的結(jié)果與分析

腸道微生物最重要的代謝功能是能夠發(fā)酵食物中由宿主自身不能消化，分解的碳水化合物，其中就包括大分子植物多糖，將其轉(zhuǎn)化為代謝終產(chǎn)物——SCFA。SCFA可以促進(jìn)宿主代謝，對保持腸道屏障完好無損至關(guān)重要[16]。此外，這些代謝物與人體正常的葡萄糖水平存在廣泛關(guān)聯(lián)[32]。乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸的氣質(zhì)圖譜如圖8所示。

1-乙酸；2-丙酸；3-異丁酸；4-正丁酸圖8 短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣質(zhì)圖譜Fig.8 Temperament profile of standard short-chain fatty acids

如圖9-a所示，與空白組相比，添加不同組分BDPs的嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)基經(jīng)體外發(fā)酵48 h后SCFA總含量均得到了不同程度的提高(P<0.05)。BDPs-80酵解組乙酸、丙酸、正丁酸含量顯著高于BDPs-70(P<0.05)；BDPs-90酵解組異丁酸含量較對照組高(P<0.05)。

a-嗜酸乳桿菌；b-大腸桿菌圖9 不同組分BDPs對細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸的影響Fig.9 Effects of different components of BDPs on bacteria fermentation to produce short-chain fatty acids注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

將不同組分BDPs作為生長因子加入到大腸桿菌的培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)基中的SCFA含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖9-b所示，SCFA總量較空白組均在一定程度上減少(P<0.05)，意味著大腸桿菌幾乎不能利用BDPs產(chǎn)SCFA。BDPs-80酵解組SCFA含量顯著低于對照組(P<0.05)。

綜上可推測不同組分BDPs可通過促進(jìn)腸道有益菌和抑制致病菌的生長，從而改變腸道菌群的組成，酵解產(chǎn)生更多有益SCFA，有針對性地改善Ⅱ型糖尿病[16]。

3 結(jié)論與討論

黃刺干果經(jīng)分級醇沉后得到分子質(zhì)量不同的3個組分多糖：BDPs-70、BDPs-80及BDPs-90，綜合對比3個組分BDPs在同一自由基清除體系或糖苷酶抑制體系，及同一組分BDPs在不同的自由基清除體系和糖苷酶抑制體系中的抗氧化及降血糖能力，顯示BDPs-90和BDPs-80的體外抗氧化和降血糖能力較強，可以作為下一步研究的重點。本實驗通過對嗜酸乳桿菌和大腸桿菌體外發(fā)酵不同組分BDPs產(chǎn)SCFA的研究發(fā)現(xiàn)，3種多糖作為碳源均能增加有益菌的豐度和SCFA含量，抑制致病菌的生長，其中BDPs-90對嗜酸乳桿菌體外增殖效果顯著，BDPs-80能有效抑制大腸桿菌的生長活性。

綜上所述，黃刺多糖作為具有一定開發(fā)潛力的天然降糖物質(zhì)，在糖尿病的預(yù)防和治療中具有廣泛前景。根據(jù)生物學(xué)活性及初步表征的結(jié)果，推測不同組分BDPs降血糖能力存在差異可能與多糖的分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。但試驗還存在諸多問題，如未對不同組分BDPs進(jìn)行分離純化，不能排除粗多糖中其他雜質(zhì)對活性的影響，體外發(fā)酵多糖未結(jié)合pH變化曲線，單一菌群難以體現(xiàn)腸道微生物的多樣性，難以模擬人體內(nèi)部環(huán)境，不能闡明多糖多途徑的調(diào)節(jié)腸道健康的過程，因此對生物體內(nèi)緩解氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)血糖及對腸道微生物的作用機制還有待進(jìn)一步的試驗驗證。