兒童腸道中乳酸菌的分離、鑒定及其降解3-甲基吲哚的功能研究

莊偉偉，朱雅琴，曾獻春

1(新疆特殊環(huán)境物種保護與調控生物學實驗室，中亞區(qū)域有害生物聯合控制國際研究中心，干旱區(qū)植物逆境生物學實驗室，新疆師范大學 生命科學學院，新疆 烏魯木齊，830054)2(四川省南充市西充縣農業(yè)農村局，四川 南充，637200)3(成都醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院，四川 成都，610500)

數字化時代改變著人們生活方式的同時，也讓部分人群形成了不健康的飲食習慣，這無疑增加了消化道系統疾病患病風險。目前臨床上常見的腸道疾病有便秘、炎癥性腸病、壞死性小腸結腸炎、短腸綜合征、大腸癌等[1]。其中便秘的患病率最高，大約30%的人在一生中會經歷便秘，老年人和婦女受之影響更甚[2]。便秘會導致腸道內積累大量毒素，如3-甲基吲哚、吲哚等[3]。3-甲基吲哚俗稱糞臭素(skatole, SK)，它是由特定的細菌在腸道內發(fā)酵L-色氨酸形成，可經肝臟代謝后隨糞便排出體外，廣泛存在于廢水和牲畜糞便中。如果3-甲基吲哚等腸道毒素長期在體內積蓄會影響腸道微生態(tài)環(huán)境，引起腐敗菌和致病菌大量繁殖，它們分解食物、膽汁的過程又會產生3-甲基吲哚、吲哚、硫化氫和氨等腸道毒素，形成惡性循環(huán)，可能將導致機體發(fā)生病理變化[4]。

大量研究表明乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)除具有降低腫瘤發(fā)病率[5]、血清中的膽固醇含量[6]、抑制腸道致病菌[7]外，還可以降解食源性致癌物質如雜環(huán)胺、亞硝酸鹽、多種霉菌毒素[8]，降解腸道致癌代謝產物如吲哚、3-甲基吲哚、硫化氫、酚類、有機胺和氨等[9]。其降解機制是乳酸菌可產生分解有機物、內毒素、亞硝胺、脂肪酸的特殊酶系[10]，嗜熱鏈球菌是目前益生功能明確、應用范圍最廣的益生菌，常被用作乳制品發(fā)酵劑，因此本實驗將它作為陽性對照菌株，評價來源于兒童腸道乳酸菌的益生功能。

目前所篩選的具有降解3-甲基吲哚的微生物非常有限，且主要來自于食品[10]，而從人體腸道篩選乳酸菌用于降解3-甲基吲哚的研究很少。因此，本研究采集健康兒童腸道中的糞便，利用MRS培養(yǎng)基分離、純化乳酸菌，通過過氧化氫酶實驗和16S rRNA基因測序，確定其分類地位。在體外將乳酸菌培養(yǎng)于以3-甲基吲哚為唯一碳源、氮源的無機鹽培養(yǎng)基中，通過測定3-甲基吲哚的殘留量，篩選能夠降解3-甲基吲哚的菌株。旨在從健康兒童腸道分離的乳酸菌中獲得安全并具有益生作用的菌株，為今后降解腸道毒素、改善便秘提供更多的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌：無菌采集8名3～8歲健康兒童糞便，并且這些兒童在3個月內未服用過抗生素，置于4 ℃冰箱冷藏備用，2 h內完成取樣。

MRS液體培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、蛋白酶K、RNA酶，北京鼎國昌盛有限公司；PCR 程序所需的細菌通用引物、擴增試劑盒、細菌基因組DNA快速提取試劑盒，上海惠凌生物技術有限公司；PCR 產物檢測所需的瓊脂糖、DeRed 核酸染料等，北京泛博生物化學有限公司；溶菌酶，上海生工生物工程股份有限公司；3-甲基吲哚標準品，Aladdin工業(yè)公司；三氯甲烷(色譜純)，成都市科隆化學品有限公司；聚醚砜進口膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；PCR擴增儀、微量分光光度計、3001酶標儀，賽默飛世爾科技公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；化學發(fā)光凝膠成像檢測儀，Bio-Rad公司；HNY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器股份有限公司；Agilent 7890A-5977B氣相色譜-質譜聯用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 兒童腸道中乳酸菌的初步篩選

無菌取1 g新鮮兒童糞便懸于9 mL氯化鈉溶液中，渦旋混勻，并用鹽溶液連續(xù)10倍梯度稀釋，涂布接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，直至菌落生長。挑取表面光滑、凸圓、邊緣完整、顏色呈乳白色的單個菌落反復分離純化3次后，挑取疑似乳酸菌進行后續(xù)驗證試驗。并將疑似乳酸菌接種到斜面培養(yǎng)基中，于4 ℃冰箱貯存；一部分保存于25%甘油中，-80 ℃保藏。

1.3.2 菌株的細胞形態(tài)觀察及分子生物學鑒定

對分離的疑似乳酸菌進行革蘭氏染色，并在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。再挑取固體培養(yǎng)基上單克隆菌落于潔凈試管內，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，觀察結果。再根據分子生物學鑒定方法，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取液體培養(yǎng)基中的菌株DNA。判定DNA提取純度后，分別將8株菌的16S rRNA基因序列27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行擴增，引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。得到的PCR產物送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。最后將各菌的16S rRNA基因測序結果在GenBank中獲取登錄號，并與GenBank上所提交的細菌序列進行比對，通過Blast功能篩選出同源性較高的菌，使用MEGA 7.0進行系統發(fā)育分析，以自展數 (bootstrap)為1 000，鄰接法構建系統發(fā)育樹，確定所篩選菌株種屬。

1.3.3 體外篩選具有降解3-甲基吲哚的乳酸菌

將0.03 g 3-甲基吲哚加入到300 mL無機鹽培養(yǎng)基中，使其質量濃度為100 mg/L，高壓滅菌后，將活化后的菌體以5%接種量接入無機鹽培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩避光培養(yǎng)。每個菌做3個重復。每隔12 h取樣，使用酶標儀測定3-甲基吲哚降解菌的吸光度值(600 nm)，了解菌株生長情況；使用GC-MS聯用色譜儀測定3-甲基吲哚殘留量，了解菌株對3-甲基吲哚的降解能力。并以嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophiles)為陽性對照菌。

(1)

式中：A為3-甲基吲哚初始量，%；B為3-甲基吲哚殘留量，%。

1.3.3.1 GC-MS聯用條件

色譜條件：色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 μm,0.25 μm)；載氣：氦氣(99.999%)；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：分流進樣；分流比：50∶1；程序升溫：初始溫度130 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速度升溫到265 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫到300 ℃，保持1 min，最后以30 ℃/min的速度升溫到265 ℃，再以20 ℃/min的速度升溫到360 ℃，保持10 min。

質譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿150 ℃，電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲2.5 min；掃描方式：全掃描模式，掃描范圍為20～550[11]。質譜庫：NIST2011。

1.3.3.2 3-甲基吲哚標準曲線的制定

稱取0.01 g 3-甲基吲哚標準品置于50 mL容量瓶中，用三氯甲烷配制成200 mg/L的標準貯備液。測樣品時移取貯備液置于加蓋EP管中，用三氯甲烷稀釋1倍配成100 mg/L的標準質量濃度，再吸取標準質量濃度100 mg/L的液體1.0、0.8、0.5、0.3、0.15 mL，用三氯甲烷配成質量濃度為100、80、50、30、15 mg/L的混合標準系列工作溶液。經0.45 μm濾膜過濾后上GC-MS聯用儀檢測。以保留時間定性，峰面積外標法定量，繪制標準曲線。以定性離子[質荷比(m/z)，130]的峰面積為縱坐標，其濃度為橫坐標，求出標準曲線方程，以此計算被測樣品中3-甲基吲哚的殘留量。

1.3.3.3 萃取

取2 mL培養(yǎng)的無機鹽培養(yǎng)基，加入2 mL三氯甲烷，渦旋振蕩混勻后，用超聲波超聲，再靜置60 min，用一次性針管收集下層三氯甲烷萃取液。經0.45 μm濾膜過濾后加入進樣瓶中，GC-MS聯用儀測定無機鹽培養(yǎng)基中3-甲基吲哚的殘留量。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0統計軟件對各實驗數據進行方差分析和顯著性檢驗。每組實驗數據以平均數±標準差(x±σ)表示，多組間比較采用單因素方差分析法，P<0.05為顯著性差異，P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選

通過平板涂布法和革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗，對從兒童腸道中分離得到的菌株進行篩選，共計8株疑似乳酸菌，用LAB1、LAB2、LAB3、LAB4、LAB5、LAB6、LAB7和LAB8命名，革蘭氏染色為紫色，為革蘭氏陽性菌(圖1)。鏡檢結果發(fā)現除LAB1為短桿狀的規(guī)則桿菌外，其余7株菌均為球菌，因此可以初步鑒定LAB1為乳桿菌。8株菌的過氧化氫酶實驗結果均為陰性，且溶鈣圈為陽性，說明它們對過氧化氫具有耐受能力，具備一定的產酸能力，滿足乳酸菌過氧化氫酶的特征。

a-LAB1;b-LAB2;c-LAB3;d-LAB4;e-LAB5;f-LAB6;g-LAB7;h-LAB8圖1 菌株鏡檢圖(×1 000)Fig.1 Microscopic image of the strains (×1 000)

2.2 乳酸菌的分子鑒定

通過CTAB法提取供試菌株的總基因組DNA，8株菌的DNA范圍為51～141.1 g/mL，且8株菌的A260/A280值均在1.7～1.9，表明這8株菌DNA純度較高，提取效果較好。如圖2所示，8株菌擴增片段約為1 500 bp左右，符合預期大小。

圖2 菌株LAB1～LAB8 PCR擴增電泳圖Fig.2 LAB1-LAB8 strains PCR amplification electrophoresis

將獲得的8株菌的16S rRNA序列向GenBank申請，并獲得登錄號，登錄號為MN867654～MN867661，與GenBank相近的序列比對結果如表1所示。將16S rRNA測序結果與GenBank中BLAST比對，構建系統發(fā)育樹(圖3)。由圖3可知，LAB1 (MN867660)與干酪乳桿菌屬(Lactobacilluscasei)的相似性達99%以上，隸屬于干酪乳桿菌屬。LAB2 (MN867661)與類腸膜魏斯氏菌屬(Weissellaparamesenteroides)的相似性達99%以上，隸屬于類腸膜魏斯氏菌屬。菌株LAB3(MN867654)、LAB5 (MN867659)、LAB6(MN867655)、LAB7(MN867656)和LAB8(MN867657)與腸膜明串珠菌屬(Leuconostocmesenteroides)的相似性均為100%，隸屬于腸膜明串珠菌屬。LAB4(MN867658)與格氏乳球菌屬(Lactococcusgarvieae)的相似性達100%，隸屬于格氏乳球菌屬。

表1 八株菌菌株16S rRNA基因序列Blast比對結果Table 1 Eight lactic acid bacteria strains 16S rRNA gene sequence alignment results blast

圖3 菌株LAB1～LAB8基于16S rRNA基因序列構建的系統發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain LAB1-LAB8 based on 16S rRNA gene sequence

2.3 3-甲基吲哚的定性結果及回收率的測定

采用保留時間對照法比較標準樣品和待測樣品色譜圖中的相對保留時間。標準樣品3-甲基吲哚的保留時間即出峰時間約為14.012 min。采用全掃描方式，在20～550 u進行定性，3-甲基吲哚的定性離子m/z為130.0、103.0、77.0。

制定3-甲基吲哚的標準曲線，以峰面積為縱坐標，其濃度為橫坐標，求出標準曲線方程，曲線方程為y=89 363x-877 234 (y是峰面積，x是濃度)，R2=0.998 4。采用空白標樣加入法測定方法回收率，將3-甲基吲哚標準品測定量與標準品加入量的比值作為回收率，結果如表2所示，3-甲基吲哚的回收率為90%～111%。

表2 3-甲基吲哚測定方法的回收率Table 2 Recovery rate of testing method of 3-methylindole

2.4 兒童腸道乳酸菌對3-甲基吲哚的降解能力比較

以嗜熱鏈球菌作為陽性對照菌，觀察乳酸菌對3-甲基吲哚的降解能力。菌株的生長曲線及降解曲線如圖4所示。乳酸菌在培養(yǎng)初期生長十分緩慢，LAB1、LAB2、LAB4、LAB6、LAB7和嗜熱鏈球菌的遲緩期為24 h，LAB3和LAB8的遲緩期為36 h，LAB5的遲緩期為48 h。菌株LAB1 和LAB4在培養(yǎng)48 h后進入穩(wěn)定期，菌株LAB2 和LAB5在72 h后進入穩(wěn)定期，菌株LAB3 和LAB8在60 h后進入穩(wěn)定期，菌株LAB6、LAB7和嗜熱鏈球菌在36 h后進入穩(wěn)定期。

a-LAB1；b-LAB2；c-LAB3；d-LAB4；e-LAB5；f-LAB6；g-LAB7；h-LAB8圖4 八株菌生長曲線和3-甲基吲哚降解曲線Fig.4 Growth curve and 3-methylindole degradation curve of 8 strains

乳酸菌在培養(yǎng)初期，對3-甲基吲哚的降解率低，菌株適應環(huán)境后，隨著培養(yǎng)時間的延長，乳酸菌利用3-甲基吲哚生長繁殖，對3-甲基吲哚的降解率也逐步升高。在為期168 h的培養(yǎng)時間內，8株菌對3-甲基吲哚的降解情況詳細見表3。在菌株生長平穩(wěn)后，LAB1～LAB8和嗜熱鏈球菌對3-甲基吲哚的降解率分別為1.56%、18.18%、4.31%、14.67%、14.77%、17.60%、1.53%、6.65%、9.08%。當培養(yǎng)時間為168 h時，8株菌株降解率分別為62.21%、60.45%、52.50%、62.19%、61.91%、61.94%、55.34%、58.73%，LAB1(干酪乳桿菌，Lactobacilluscasei)對3-甲基吲哚的降解率最高，且高于陽性對照菌嗜熱鏈球菌(59.44%)。

表3 不同乳酸菌對3-甲基吲哚的降解率Table 3 Degradation rate of 3-methylindole by different lactic acid bacteria

3 結論與討論

乳酸菌來源十分廣泛，本實驗從健康兒童腸道中篩選得到8株菌，歸屬為干酪乳桿菌屬、類腸膜魏斯氏菌屬、腸膜明串珠菌屬、格氏乳球菌屬。8株乳酸菌在整個培養(yǎng)周期，對3-甲基吲哚的降解趨勢呈現相似的規(guī)律。菌體群體生長的遲緩期，開始適應新的培養(yǎng)環(huán)境，微生物的數量沒有增加，3-甲基吲哚含量變化也不大；隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體快速生長，進入對數生長期，乳酸菌對3-甲基吲哚的降解速率逐漸增加；隨后菌株生長到達穩(wěn)定期，菌體數量達到最大，降解速率也開始快速升高。分析結果可知8乳酸菌在進入快速生長期過度到生長穩(wěn)定期，3-甲基吲哚的降解率也隨之增加，分析原因可能是菌體在適應3-甲基吲哚脅迫培養(yǎng)后，因自身生長利用了培養(yǎng)基中唯一的有機物3-甲基吲哚，使培養(yǎng)基中3-甲基吲哚的含量逐漸降低。

由于3-甲基吲哚具有生物毒性且很難去除，目前所篩選的具有降解3-甲基吲哚的微生物非常有限[11-12]。有研究報道伯克霍爾德菌IDO3在pH值4.0～9.0、轉速0～250 r/min、溫度30～35 ℃的條件下，有降解3-甲基吲哚的能力[12]。沼澤紅假單胞菌 WKU-KDNS3在72 h內對濃度為1 mmol/L 的3-甲基吲哚去除率為48%[13]。銅綠假單胞菌Gs培養(yǎng)36 h時可完全去除濃度為0.5 mmol/L的3-甲基吲哚[14]，不動桿菌NTA1-2A和不動桿菌 TAT1-6A 72 h內可去除65 mg/L的3-甲基吲哚[15]。來自海洋沉積物的產甲烷細菌聯合體將3-甲基吲哚轉化為3-甲氧基吲哚，而硫酸鹽還原菌聯合體完全通過3-甲氧基吲哚和α-甲基-2-氨基苯乙酸將3-甲基吲哚礦化[16]。BOROWSKI等[17]研究了含有假單胞菌、芽孢桿菌和乳酸菌的微生物礦物制劑去除雞糞中令人不快的氣味。其結果發(fā)現乳酸菌屬、假單胞菌屬和銅綠菌屬都能夠降解3-甲基吲哚。而直接將乳酸菌添加到豬糞尿中，厭氧發(fā)酵發(fā)現，乳酸菌可降低發(fā)酵后期3-甲基吲哚的含量[18]。

本實驗獲得的8株乳酸菌對3-甲基吲哚都具有一定的降解作用，降解率在52.50%～62.21%。我們發(fā)現從兒童腸道微生物中篩選的干酪乳桿菌屬、類腸膜魏斯氏菌屬、腸膜明串珠菌屬、格氏乳球菌屬的乳酸菌均能夠降解3-甲基吲哚，其中降解能力最強的是干酪乳桿菌，降解率達62.21%，且高于陽性對照菌嗜熱鏈球菌的降解率(59.44%)。有學者研究了短乳桿菌1.12、植物乳桿菌102、干酪乳桿菌6103和植物乳桿菌ATCC8014對質量濃度為0.1 μg/mL的3-甲基吲哚的降解能力差異，結果顯示短乳桿菌1.12的降解能力最強，去除率為(65.35±0.3)%，干酪乳桿菌6103為(52.15±0.3)%[19]，與本實驗的研究結果較一致。盡管乳酸菌對3-甲基吲哚降解能力的研究較少，但目前的研究已初步表明乳酸菌具有降解3-甲基吲哚的能力。本實驗結果豐富了降解腸道毒素的微生物資源，同時也為今后擴展乳酸菌的應用范圍提供了切實可行的理論依據。