腦疏寧膠囊對(duì)小鼠的急性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)觀察

劉慶義，張寰，嚴(yán)云卷，陳彤，楊媛，張梅奎

1 解放軍總醫(yī)院 遠(yuǎn)程醫(yī)學(xué)中心，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853；3 戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100101

腦疏寧膠囊是解放軍總醫(yī)院中醫(yī)世家張梅奎主任歷經(jīng)多年臨床研究探索出的治療腦卒中的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效確切，毒性、不良反應(yīng)小[1]。該方由益母草、水蛭、三七、川牛膝等8 味中草藥組成，具有活血逐瘀，利水通腑之功效，適用于缺血性腦卒中急性期及恢復(fù)期，屬痰瘀痹阻證，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語(yǔ)蹇澀或不語(yǔ)、偏身麻木、便干便秘、頭暈?zāi)垦！⑻刀喽?、舌質(zhì)暗紅、苔黃膩、脈滑數(shù)等[2-4]。前期有效性研究表明，腦疏寧對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠恢復(fù)神經(jīng)功能、降低梗死范圍、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制炎癥細(xì)胞因子和黏附分子表達(dá)、抑制自由基生成和減輕創(chuàng)傷性腦水腫等方面的藥理作用[5-11]。前期已完成生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制體系的研究工作。本研究根據(jù)中藥新藥的申報(bào)要求[12]，通過(guò)開展腦疏寧急性毒性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究，為該藥的臨床前安全性評(píng)價(jià)、臨床劑量設(shè)計(jì)和臨床毒性、不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(20 ± 2) g，由解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(軍)2015-003。健康SD 大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量(165 ± 15) g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(軍)2015-001。動(dòng)物飼養(yǎng)于二級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)，由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水?？刂骗h(huán)境為溫度(23 ± 5)℃，濕度(60 ± 20)%，12 h 照明，12 h 黑暗。每天清潔籠子換墊料1 次。

2 藥物及主要儀器 0.9%氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司，批號(hào)H13023200。腦疏寧膠囊(0.5 g/粒) 由北京麥迪海藥業(yè)有限責(zé)任公司制備，批號(hào)：050618。本品成品相當(dāng)于5 g(生藥)/1 g(膠囊)，臨用時(shí)用水稀釋配制成45%(以膠囊內(nèi)容物計(jì)，取原料藥100 mL，稀釋至156.4 mL，濃度即為45%)的濃度備用。臨床成人日用劑量為4.5 g，按體質(zhì)量60 kg計(jì)，即0.075 g/kg。低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus 公司)；日立7020 自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；SYSMEX XT-2000iv 型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀(日本Sysmex Corporation 公司)；CA1500全自動(dòng)血凝分析儀(日本SYSMEX 公司)；多參數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(美國(guó)JT-IR 公司)；TDL-5 臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)。

3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 用最大給藥量法進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)[13-14]。選用昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，禁食不禁水16 h后，實(shí)驗(yàn)組按最大給藥量法灌胃1次，灌胃體積為0.8 mL/20 g，劑量為18 g/kg，此劑量相當(dāng)于成人用量的240 倍。對(duì)照組給予等容量0.9%氯化鈉注射液灌胃。觀察14 d 內(nèi)小鼠體質(zhì)量、活動(dòng)、行為、飲食、毛色等一般狀態(tài)及有無(wú)死亡，觀察主要臟器外觀形態(tài)有無(wú)異常表現(xiàn)。

4 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn) 按照長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的有關(guān)技術(shù)要求[15-16]，將120 只健康SD 大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只，雌雄各半，每天給藥1次，連續(xù)給藥13 周。低劑量組1.8 g/kg、中劑量組3.6 g/kg、高劑量組7.2 g/kg，對(duì)照組給予等容量0.9% 氯化鈉注射液灌胃。每天觀察動(dòng)物有無(wú)死亡及其外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、毛色、飲食、二便等一般狀況，每周稱1 次體質(zhì)量和飼料重。分別于給藥結(jié)束后24 h 及停藥后4周，取血測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)，剖取心、肝、腎、腦等臟器稱重計(jì)算臟器指數(shù)并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。最后1 次給藥后24 h，每組雌、雄各取10 只脊柱脫臼法處死進(jìn)行血液學(xué)、血液生化、臟器相對(duì)質(zhì)量及組織病理學(xué)檢查。留下的動(dòng)物繼續(xù)觀察4 周后同樣方法處死，以便了解毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況和可能出現(xiàn)的延遲性毒性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。研究資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，均先行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)計(jì)量資料以表示，多組間的比較為單因素方差分析(統(tǒng)計(jì)量為F)+兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量為L(zhǎng)SD-t)。重復(fù)觀測(cè)資料行重復(fù)測(cè)量方差分析(統(tǒng)計(jì)量為F)+兩兩組間比較LSD-t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量為L(zhǎng)SD-t)+兩兩時(shí)間比較差值t檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)量為t)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重復(fù)測(cè)量分析及分割檢驗(yàn)的多次比較按Bonferroni 校正法進(jìn)行檢驗(yàn)水準(zhǔn)調(diào)整，α'=0.05/n，n 為多次比較的次數(shù)。

結(jié)果

1 急性毒性實(shí)驗(yàn) 給藥后兩周內(nèi)小鼠活動(dòng)、行為、飲食、毛色等一般狀態(tài)未見任何異常，無(wú)死亡，主要臟器外觀未見明顯異常。實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的體質(zhì)量變化與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)，說(shuō)明腦疏寧膠囊對(duì)體質(zhì)量無(wú)明顯影響。

表1 腦疏寧膠囊急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量(g,n=20)Tab.1 Body weight of mice in acute toxicity experiment of Naoshuning capsule (g,n=20)

2 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組和低、中、高3 個(gè)劑量組動(dòng)物一般生理體征、行為活動(dòng)、外觀體征、糞便性狀等均無(wú)異常。表2 中可以看出，給藥組與對(duì)照組動(dòng)物體質(zhì)量變化總體趨勢(shì)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 腦疏寧膠囊長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量(g,n=20)Tab.2 Body weight of mice in long-term toxicity test of Naoshuning capsule (g,n=20)

2.2 血液學(xué)指標(biāo) 表3 中可以看出，高劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高(P＜0.05)，但在文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)正常參考范圍內(nèi)(2.08×109/L～ 11.78×109/L)[17]其余指標(biāo)各劑量組與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥組血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組均在正常波動(dòng)范圍。

表3 腦疏寧膠囊長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)血液學(xué)指標(biāo)(g,n=20)Tab.3 Hematologic indexes of long-term toxicity test of Naoshuning capsule (g,n=20)

2.3 血液生化學(xué)指示 表4 顯示，中劑量組和高劑量組大鼠血液谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST) 含量降低，高劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)含量降低，中劑量組肌酐(creatinine，CRE) 含量降低，但波動(dòng)均在文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)正常參考范圍內(nèi)(雄性AST：144.50～91.42 U/L[18]，雌 性AST：136.12～ 92.46 U/L[18]，雌性ALT：50.60～ 34.6 U/L[19]，雄性CRE：53.8～30.6 μmol/L[20])。各項(xiàng)血液生化指標(biāo)均未見明顯的異常波動(dòng)。

表4 腦疏寧膠囊長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)血液生化學(xué)指標(biāo)(n=20)Tab.4 Biochemical indexes of long-term toxicity test of Naoshuning capsule (n=20)

2.4 臟器指數(shù) 從表5 可以看出，各劑量組臟器指數(shù)與對(duì)照組比較，差異多數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。臟器指數(shù)無(wú)明顯變化。

表5 臟器指數(shù)變化表(g/100 g 體質(zhì)量，n=20)Tab.5 Changes of organ indexes (g/100 g body weight,n=20)

2.5 組織病理學(xué)檢查 在給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束時(shí)檢查動(dòng)物，未發(fā)現(xiàn)眼瞼、結(jié)膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶狀體、眼底異常改變。對(duì)臟器組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，給藥組各臟器細(xì)胞結(jié)構(gòu)均與對(duì)照組相似。

討論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和給藥組，急性毒性實(shí)驗(yàn)采用單次最大18 g/kg 劑量灌胃，此劑量相當(dāng)于人擬用劑量的240 倍。關(guān)于單次最大給藥量的說(shuō)明：腦疏寧膠囊原料藥濃度為1.19 g 浸膏/mL，每克浸膏含生藥3.52 g，本品制成的成品相當(dāng)于5 g(生藥)/1 g(膠囊)，由此計(jì)算，5÷3.52=1.42，即1 g 膠囊相當(dāng)于1.42 g 浸膏，每毫升中含的膠囊量即為1÷1.42=0.704 g。相當(dāng)于膠囊內(nèi)容物配制成了70.4%的濃度(因此，為方便起見，本品的濃度及給藥劑量均以膠囊內(nèi)容物計(jì)算)，稱取一定量的腦疏寧膠囊原料藥，逐漸加水稀釋至相當(dāng)于45%左右的濃度時(shí)，剛好能夠抽入灌胃注射器。大于此濃度時(shí)，藥液因黏稠而無(wú)法抽取，小鼠常規(guī)最大給藥體積一般控制在0.8 mL/20 g，急性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)z囊內(nèi)容物的最大濃度確定為45%，0.8×0.45÷0.02=18，即最大只能以18 g/kg 灌胃給藥，相當(dāng)?shù)纳幜繛?8×5=90，即相當(dāng)于90 g(生藥)/kg(體質(zhì)量)。本品臨床擬用劑量為4.5 g/d，60 kg 體質(zhì)量人用量為4.5÷60=0.075 g/kg，因此小鼠最大給藥劑量18 g/kg 相當(dāng)于人擬用劑量的倍數(shù)為18÷0.075=240 倍。給藥后兩周內(nèi)動(dòng)物活動(dòng)、行為、飲食、毛色等一般狀態(tài)未見任何異常，無(wú)死亡現(xiàn)象，心、肝、脾、肺、腎及胃腸等主要臟器外觀也未見明顯異常，體質(zhì)量變化也與對(duì)照組基本一致，各方面均未見明顯的急性毒性反應(yīng)，提示臨床劑量安全可靠，并為后續(xù)長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。

長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)給藥途徑為灌胃，與人臨床擬用途徑相同，給藥體積以最大給藥體積2 mL/100 g 體質(zhì)量計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)低、中、高劑量分別為1.8 g/kg、3.6 g/kg、7.2 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的24 倍、48 倍、96倍，最小劑量大于藥效學(xué)大劑量，其他劑量等比設(shè)計(jì)。高劑量組已經(jīng)達(dá)到臨床劑量的90 倍以上，以2 mL/100 g 體質(zhì)量的給藥體積灌胃，能夠達(dá)到在長(zhǎng)期大劑量下觀察其安全性的目的[21-23]。

給藥結(jié)束24 h 以及停藥后4周，動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、毛色、體質(zhì)量、飲食、二便等一般狀況均未見異常，血液學(xué)和血液生化指標(biāo)檢查也未見異常波動(dòng)，主要臟器外觀、濕重指數(shù)以及組織病理學(xué)觀察與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明沒有明顯的長(zhǎng)期毒性反應(yīng)，安全性較高。因此，腦疏寧膠囊并無(wú)明顯靶器官毒性。

綜上所述，腦疏寧膠囊急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)各方面均未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，表明腦疏寧膠囊按臨床擬用劑量長(zhǎng)期服用具有較高的安全性，為臨床應(yīng)用的安全性評(píng)價(jià)、臨床劑量設(shè)計(jì)和臨床毒性、不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供了科學(xué)依據(jù)，其適應(yīng)證是以發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復(fù)發(fā)率高和并發(fā)癥多等為特點(diǎn)的腦卒中[24-25]，腦卒中是嚴(yán)重威脅人民健康和生活的三大常見疾病之一。因此，本品有望成為一個(gè)具有良好開發(fā)前景的中藥新藥。