番石榴葉精油的提取、成分鑒定及對(duì)紅火蟻的生物活性分析

邵雪花，賴 多，肖維強(qiáng)，劉傳和，賀 涵，匡石滋

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

紅火蟻(Solenopsis invicta Buren)原發(fā)生于南美洲巴拉那河流域，是一種具有強(qiáng)大的繁殖力和競爭力的外來入侵害蟲[1]，其破壞能力強(qiáng)、繁殖快、食性雜、競爭力強(qiáng)且傳播途徑多，被列入自然界中100種最具危害性的外來入侵物種之一。該害蟲不僅對(duì)農(nóng)林業(yè)和環(huán)境安全產(chǎn)生巨大危害，還具有較強(qiáng)的攻擊性，嚴(yán)重危害人類健康[2]。2004年9月首次在中國廣東省吳川市發(fā)現(xiàn)[3]，到2021年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的數(shù)據(jù)顯示，紅火蟻已入侵至12個(gè)省份，448個(gè)縣（市、區(qū)）[4]，可見其擴(kuò)散快，防控難。目前對(duì)紅火蟻的防治主要是以化學(xué)防治為主，但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物造成傷害，而且會(huì)對(duì)農(nóng)、城鄉(xiāng)土壤、水源造成了不同程度的污染。研究發(fā)現(xiàn)一些觸殺性的化學(xué)藥劑如氟蟻腙和氟蟲腈等，長期使用會(huì)導(dǎo)致蟻巢內(nèi)的紅火蟻逃逸、分巢，可加快紅火蟻的擴(kuò)散蔓延[5-6]。雖然中國已投入大批量生產(chǎn)的紅火蟻藥劑有20多個(gè)品種，但高效穩(wěn)定環(huán)保的防治藥劑仍較缺乏，藥劑產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，防治效果參差不齊。植物源農(nóng)藥是一類來源廣、易獲得的天然產(chǎn)物，且具有生物降解快、害蟲不易產(chǎn)生抗性、對(duì)環(huán)境和非靶標(biāo)生物低毒等特點(diǎn)，已成為開發(fā)紅火蟻高效、低毒藥劑研究的重點(diǎn)。

番石榴(Psidium guajava L.)又稱芭樂、拔子、喇叭果、雞屎果等，為桃金娘科(Myrtaces)番石榴屬熱帶果樹，原產(chǎn)于熱帶美洲[7]，在中國福建、臺(tái)灣、廣東、海南等地均有種植，是廣東省重點(diǎn)發(fā)展的亞熱帶名優(yōu)水果品種之一[8]。番石榴中化學(xué)成分種類豐富，研究表明，果中含有較豐富的蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[9]，以及果膠、生物堿、類黃酮、三萜類、皂苷等生物活性物質(zhì)[10-11]；葉中則含有三萜、黃酮、鞣質(zhì)、倍半萜、揮發(fā)油等多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分[12-13]。其果、葉具有一定的食用價(jià)值，同時(shí)也具有出色的藥用價(jià)值，藥理研究表明，番石榴具有抗氧化、抗菌、抗腹瀉、保肝、降血糖、降血脂、降血壓、抗心血管疾病、抗腫瘤等功效[14-16]。早在1998年，SANTOS等[17]報(bào)道了番石榴葉精油及其主要成分β-石竹烯和蒎烯的鎮(zhèn)痛作用；SANCHES等[18]分別使用水和乙醇從番石榴葉、根和莖皮中提取化合物，發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有抗菌作用；RIZZO等[19]報(bào)道，番石榴葉中雜萜類成分guajadial、psidial A、psiguadial A和psiguadial B可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，且比臨床化療藥物對(duì)機(jī)體的毒性更低。但到目前為止，尚無番石榴精油對(duì)紅火蟻生物活性的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本文以番石榴葉為試材，提取其精油，確定其化學(xué)成分，并采用熏蒸法探究該精油中的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)紅火蟻的生物活性，以期為紅火蟻生物防治藥劑的開發(fā)利用提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

紅火蟻：采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所的柑橘園內(nèi)。

番石榴葉片：采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 紅火蟻：室內(nèi)擱置3～5天后，用“滴水法”將蟻群從土壤中逼出，轉(zhuǎn)移至較小的儲(chǔ)物盒。用紗網(wǎng)將紅火蟻轉(zhuǎn)移至內(nèi)側(cè)壁上涂有滑石粉的塑料盒中飼養(yǎng)。塑料盒中放有人工蟻巢、水試管、10%蔗糖溶液和黃粉蟲。于養(yǎng)蟲室人工飼養(yǎng)2周后進(jìn)行試驗(yàn)。養(yǎng)蟲室溫度為(25±2)℃，濕度為(55±10)%，采用大小一致平均頭寬為0.7(±0.1)mm的小型工蟻進(jìn)行試驗(yàn)。

番石榴精油(EO)提?。簩Ⅴr葉40℃烘干至恒重，粉碎后過20目篩[20]。稱取500 g番石榴干燥葉粉置于5 L的圓底燒瓶，按1:11(g/m L)的料液比加蒸餾水浸泡2 h，用700W功率微波照射4m in，連接回流冷凝管，油浴加熱提取5 h，待揮發(fā)油不再增加時(shí)停止加熱。將收集的揮發(fā)油按體積比1:1加正己烷進(jìn)行萃取，靜止4 h后分離，旋蒸后的液體加無水硫酸鈉脫水后即番石榴葉精油。

精油成分分析：稱取番石榴葉精油2mg于1.5m L進(jìn)樣瓶中，加入正己烷1m L振蕩使其溶解，0.22μm微孔濾膜過濾后，通過GC-MS進(jìn)行分析。精油的GCMS定量分析采用峰面積歸一化法，化合物定性采用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫[21]。

1.2.2 熏蒸活性測定 試驗(yàn)容器為帶蓋的玻璃圓筒（5 cm直徑×10 cm高），在杯口至以下2 cm處涂上滑石粉，以防紅火蟻逃脫。挑取適宜的工蟻30頭放入容器中，加入水試管（在2m L離心管中裝水并用棉花封口）提供水分。將5、10、20μL番石榴精油分別裝入有8個(gè)針孔的1.5m L離心管中，然后將管置于圓筒底部。對(duì)照(CK)只放入盛水試管，用保鮮膜密封，3次重復(fù)，分別在處理12、24、36、48 h后進(jìn)行觀察記錄。

1.2.3 紅火蟻行為能力測定 紅火蟻處理方法同1.2.2。參照文獻(xiàn)[22]的方法，在熏蒸1、3、5、7、9 h后，觀察測定紅火蟻的聚集率、攀爬率、抓附率和行走率，3次重復(fù)。3只及3只以上成團(tuán)確定為聚集；將紅火蟻引上標(biāo)記好距離的竹簽上，在竹簽上爬行6 cm則確定為具有攀爬能力；用竹簽將紅火蟻挑入塑料杯中，輕微震動(dòng)塑料杯使紅火蟻工蟻在杯底處散開，翻轉(zhuǎn)該塑料杯使杯口向下，5 s后未掉落的工蟻則被認(rèn)為具有抓附能力；紅火蟻放在畫圓的白紙上，讓紅火蟻?zhàn)匀恍凶?，能連續(xù)行走3 s的則確定為具有行走能力。每個(gè)時(shí)間段測試結(jié)束后將紅火蟻接回原杯。

1.2.4 酶活力測定 取約0.1 g紅火蟻（處理：番石榴精油10μL/管；對(duì)照：清水），加入1m L提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃12000 r/m in離心10m in，取上清，置冰上待測。參考試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司，G0105W；G0908W）說明書的方法進(jìn)行并略作改進(jìn)。酶標(biāo)儀預(yù)熱30 m in以上，調(diào)節(jié)波長至510 nm測定CAT，450 nm處測定CarE。

W為樣本質(zhì)量，g；D為稀釋倍數(shù)，若未稀釋則值為1。

1.2.5 生物堿測定 取活的紅火蟻（處理：番石榴精油10μL/管；對(duì)照：清水）后腹部稱取1 g于-20℃的冰箱中1 h，取出后用3.5m L色譜級(jí)正己烷浸提48 h，取出浸提液，加入少量無水硫酸鈉處理12 h后，用高純氮?dú)獯抵?m L，置于4℃冰箱冷藏備用。取1.0m L工蟻浸提液，用硅膠柱層析法（20.0 g 300～400目硅膠載入直徑17mm玻璃柱）分離生物堿。用正己烷與丙酮按比例沖洗硅膠柱并收集流分，用GC-MS（美國Agelent Technologies公司7890A-5975C）分析其所含的生物堿成分及其相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著；采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番石榴葉精油(EO)的成分鑒定

利用GC-MS進(jìn)行EO的化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)主要是單萜、倍半烯萜、醇、醛、酮和酯的混合物。由表1可知，共鑒定出31種化合物，占EO總量的89.35%。其中，倍半烯萜類化合物含量最高，占EO總量的76.41%，其主要化合物為caryophyllene(37.86%)，其次是(z)-α-bisabolene(8.69%)、(4E,8E)-β-humulene(7.43%)和α-santalene(6.66%)；醇類占EO總量的11.43%，其中nerolidol是主要化合物含量為7.61%，其次是[1R-(1α,3)]-4-ethenyl- α,α,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)-cyclohexanemethanol含量為2.19%。

表1 番石榴精油的化學(xué)成分

續(xù)表1

2.2 番石榴葉精油(EO)對(duì)紅火蟻的熏蒸活性測定

從圖1可以看出，EO可致小型紅火蟻工蟻死亡，且隨劑量升高和時(shí)間延長呈上升趨勢。EO為5μL/管，熏蒸時(shí)間在12、24、36 h時(shí)對(duì)紅火蟻沒有明顯的活性，與對(duì)照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，48 h的死亡率為9.8%，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。10μL/管和20μL/管的EO對(duì)紅火蟻的熏蒸活性，與對(duì)照組相比差異均顯著(P＜0.05)，且在48 h紅火蟻的死亡率分別為61.55%和93.71%。可見，低劑量的EO對(duì)紅火蟻的活性較差，當(dāng)劑量高于10μL/管時(shí)，EO對(duì)小型紅火蟻具有較好的熏蒸活性。

圖1 番石榴葉精油(EO)對(duì)紅火蟻的熏蒸活性

2.3 番石榴葉精油(EO)對(duì)紅火蟻行為能力的影響

2.3.1 聚集率 從圖2看出，小型紅火蟻的聚集率隨處理劑量升高和時(shí)間延長而降低，且不同處理劑量和時(shí)間分別與對(duì)照組相比，聚集率均呈顯著下降趨勢(P＜0.05)。5μL/管的EO熏蒸紅火蟻1 h到9 h，聚集率從87.27%下降至58.31%；10μL/管的聚集率從87.78%下降至37.51%；20μL/管的聚集率從88.42%下降至10.82%；而對(duì)照組的紅火蟻聚集率僅下降了10%左右?？梢?，EO的劑量越高紅火蟻聚集率下降越快。

2.3.2 攀爬率 由圖2可知，EO在中低劑量（10μL/管和5μL/管）下對(duì)紅火蟻的攀爬率有抑制效果，但效果較差，5 h前與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)；EO 20μL/管熏蒸紅火蟻9 h后，其攀爬率下降了45%左右，而EO 5μL/管和10μL/管的處理組只下降了10%左右，對(duì)照組僅下降1%?？梢?，EO在較高劑量下對(duì)紅火蟻的攀爬行為有顯著的抑制作用。

2.3.3 抓附率 EO對(duì)紅火蟻的抓附率有明顯的抑制效果，且劑量越高抑制效果越顯著（圖2）。處理后1 h到9 h，20μL/管的EO熏蒸后紅火蟻的抓附率下降了34%左右，10 μL/管的下降了24%左右，而5μL/管的下降了20%左右，對(duì)照組僅下降9%左右?？梢?，EO在較高劑量（10μL/管和20μL/管）下對(duì)紅火蟻的攀爬行為有顯著抑制活性，與對(duì)照相比顯著下降(P＜0.05)。

圖2 番石榴精油(EO)對(duì)紅火蟻聚集率、攀爬率、抓附率和行走率的影響

2.3.4 行走率 EO熏蒸紅火蟻3 h后，高劑量（20μL/管）處理的紅火蟻行走率呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，熏蒸1 h到9 h，行走率從97.77%下降至57.23%；EO 5μL/管和10μL/管處理下僅下降了10%左右，且2個(gè)劑量處理下的抑制效果并無顯著差異(P＞0.05)；對(duì)照組的紅火蟻行走率保持在99%左右?？梢?，EO可顯著抑制紅火蟻的行走行為。

2.4 EO對(duì)紅火蟻體內(nèi)CarE和CAT的影響

由表2可知，EO 10 μL/管熏蒸紅火蟻12、24、36、48、60 h后，處理組的過氧化氫酶(CAT)的活性呈下降趨勢，并顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，處理60 h后，由8.41 μmoL/(min·g)下降至3.93 μmoL/(m in·g)。EO熏蒸后的紅火蟻體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)的活性也呈下降趨勢，但處理12 h和24 h后與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)；36、48、72 h后均呈顯著下降趨勢(P<0.05)。這說明小型紅火蟻工蟻經(jīng)EO熏蒸處理后，其體內(nèi)CAT和CarE的活性均顯著下降。

表2 番石榴葉精油熏蒸紅火蟻后體內(nèi)酯酶的活性

2.5 番石榴精油對(duì)紅火蟻體內(nèi)生物堿的影響

紅火蟻具有很強(qiáng)的攻擊性，對(duì)人最直接的危害就是它們的蜇咬行為會(huì)造成局部強(qiáng)烈的灼燒感，被大量紅火蟻蜇咬的人可能昏迷甚至死亡。紅火蟻的強(qiáng)大毒力與其毒腺分泌物密切相關(guān)，這類化合物的主要成分是哌啶生物堿混合物。通過對(duì)番石榴精油處理前后紅火蟻生物堿組分分析，發(fā)現(xiàn)處理后的紅火蟻只檢測到6種生物堿，而對(duì)照組檢測到12種。即化合物1-piperidine，1-piperidine，4-chloro-1-methyl-piperidine，2-methyl-6-tridecyl-6-piperideine，3,5-dichlorobenzoate-2-piperidine和1-(2-phenylethyl)-piperidine 6種生物堿在番石榴精油處理后未被檢測到（表3）。由此可見，番石榴精油可阻礙紅火蟻的毒腺分泌，降低其毒性。

表3 紅火蟻體內(nèi)生物堿含量檢測

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，番石榴葉精油(EO)的主要成分為caryophyllene、(z)-α-bisabolene、(4E,8E)-β-humulene、α-santalene和nerolidol，這與以往研究中發(fā)現(xiàn)的主要成分 為 isocaryophyllene、veridiflorene、farnesene、dllimonene、d-cadinene、α-copaene 和 a-humuleneandιcadinol不同[23]。已有研究表明，同一植物精油的化學(xué)成分不同，這與特定的氣候條件、土壤條件、所收集植物的品種、部位及收集時(shí)間和提取方法等因素相關(guān)[24-25]。FERNANDES等[26]從番石榴花中提取精油，發(fā)現(xiàn)主要成分是 α-selinene、β-selinene、α-cadinol、βcaryophyllene、 caryophyllene oxide 和 nerolidol；Azulene、caryophyllene、cineole、eucalyptol和 copaene Azulene是印度番石榴葉精油的主要成分[27]?？梢?，番石榴不同品種、不同部位及不同采集地點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致其提取的精油成分差異較大。

以往研究結(jié)果表明，番石榴葉精油具有抗氧化、抗菌和抗癌等多種生物活性，但在防控紅火蟻方面未見報(bào)道。紅火蟻?zhàn)鳛樽罹呶：π缘耐鈦砣肭治锓N之一，其繁殖快、擴(kuò)散能力強(qiáng)，防控難，高毒性化學(xué)農(nóng)藥通常會(huì)導(dǎo)致蟻巢內(nèi)的紅火蟻逃逸、分巢，加快紅火蟻的擴(kuò)散蔓延。紅火蟻工蟻一般在蟻群中負(fù)責(zé)食物搬運(yùn)、傳遞信息、尋找蟻穴等職能，其聚集、攀爬、行走和抓附能力對(duì)其生存、覓食及遷巢等具有重作用，抑制其行為能力，可有效控制其種群擴(kuò)散、蔓延。本文中筆者發(fā)掘番石榴葉精油對(duì)小型紅火蟻工蟻具備良好的熏蒸活性，可顯著降低紅火蟻的聚集、攀爬、抓附和行走等行為能力，且在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，隨劑量的增加和時(shí)間的延長防控效果增強(qiáng)；另一方面番石榴葉精油還可阻礙紅火蟻毒腺生物堿的分泌，使哌啶化合物的組分降低50%。紅火蟻具有蟄針，能夠分泌毒液，具有強(qiáng)烈的進(jìn)攻性，在生物種群競爭中有一定優(yōu)勢[28]，毒腺生物堿是紅火蟻攻擊危害的主要毒素成分，與紅火蟻能夠成功入侵并定殖有重要關(guān)系。番石榴精油在高濃度下對(duì)小型紅火蟻工蟻有較好的熏蒸活性，低濃度下可抑制其行為能力及生物堿的分泌，可有效控制紅火蟻的種群數(shù)量及遷巢和擴(kuò)散，同時(shí)減輕對(duì)人類造成的危害，這在紅火蟻的綜合防治上有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，但需要大量田間實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并與化學(xué)農(nóng)藥有機(jī)結(jié)合，可有望達(dá)到最佳防治效果。

當(dāng)機(jī)體的氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡狀態(tài)被打破時(shí)，會(huì)產(chǎn)生丙二醛(MDA)，MDA具有細(xì)胞毒性。過氧化氫酶(CAT)是一類主要起催化底物氧化還原反應(yīng)的酶，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)羥基自由基及超氧陰離子的抑制能力，并且可顯著減少M(fèi)DA的含量[29]。羧酸酯酶(CarE)是昆蟲體內(nèi)重要的一種解毒酶，幾乎在昆蟲的各個(gè)組織中均有分布，CarE可通過阻斷作用來分解外源有毒有害物質(zhì)進(jìn)行解毒，或與有毒物質(zhì)相結(jié)合使其無法達(dá)到作用靶標(biāo)。本研究顯示，番石榴精油熏蒸紅火蟻不同時(shí)間后，供試紅火蟻體內(nèi)的過氧化氫酶(CAT)和羧酸酯酶(CarE)活性均顯著低于對(duì)照?？梢姡摼涂善茐臋C(jī)體的氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，導(dǎo)致紅火蟻的解毒能力降低，延長番石榴精油在紅火蟻體內(nèi)的作用時(shí)間加速其死亡，但其作用機(jī)理仍需深入探討。

綜上所述，番石榴葉精油可通過蒸餾法進(jìn)行有效提取，其成分經(jīng)GC-MS鑒定可得到31種化合物，占總含量的89.35%，其中caryophyllene(37.86%)為主要化合物 ，其 次 是 (z)-α-bisabolene(8.69%)、(4E,8E)-βhumulene(7.43%)和 α-santalene(6.66%)；生測結(jié)果表明，20μL/管的精油熏蒸紅火蟻工蟻48 h，死亡率達(dá)90%以上；20μL/管精油熏蒸紅火蟻9 h，其聚集率從88.42%下降至10.82%，攀爬率下降了45%左右，抓附率下降了34%，行走率從97.77%下降至57.23%；體內(nèi)保護(hù)酶過氧化氫酶(CAT)和羧酸酯酶(CarE)酶活力分別降低了56.62%和58.57%；哌啶化合物的組分降低了50%。可見，番石榴葉精油不僅對(duì)紅火蟻表現(xiàn)出優(yōu)異的熏蒸活性，還可顯著抑制紅火蟻的行為能力（聚集、攀爬、抓附和行走），同時(shí)降低體內(nèi)CAT和CarE的酶活力并抑制生物堿的分泌，本研究為后期番石榴的深度開發(fā)提供理論依據(jù)，還為紅火蟻的生物防治提供借鑒。