車車前前草草醇醇提提取取液液對(duì)對(duì)海海魚魚腐腐敗敗細(xì)細(xì)菌菌的的抑制作用

◇海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院 陳達(dá)宏 唐秀琴 馬紅梅

隨著生活條件越來(lái)越好，海魚逐漸成為人類餐桌上必不可少的食物。但是捕撈后的海產(chǎn)品在運(yùn)輸路程中和儲(chǔ)藏期間容易出現(xiàn)易氧化和細(xì)菌的快速繁殖，從而導(dǎo)致魚肉變質(zhì)和腐敗。本文研究車前草提取物對(duì)九種海魚表體常見細(xì)菌的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：車前草80%醇提取液可以有效抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和普通變形桿菌的生長(zhǎng)繁殖，為車前草制成海魚的環(huán)保食用保鮮劑提供了理論依據(jù)。

隨著生活條件越來(lái)越好，海魚逐漸成為人類餐桌上必不可少的食物。但是捕撈后的海產(chǎn)品在運(yùn)輸路程中和儲(chǔ)藏期間容易出現(xiàn)易氧化和細(xì)菌的快速繁殖，從而導(dǎo)致魚肉變質(zhì)和腐敗。本文研究車前草提取物對(duì)九種海魚表體常見細(xì)菌的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：車前草80%醇提取液可以有效抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和普通變形桿菌的生長(zhǎng)繁殖，為車前草制成海魚的環(huán)保食用保鮮劑提供了理論依據(jù)。

車前草（學(xué)名：Plantago asiatica L.），為車前科車前屬，別名車輪菜、當(dāng)?shù)?、鳳眼車前等，二年生或多年生植物[1]，中國(guó)多省份均能適宜生長(zhǎng)。車前草適應(yīng)能力極強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)格，常見于草地，河岸邊，路旁兩道或田野山間等，在20℃～30℃的溫度范圍內(nèi)其莖葉均能正常生長(zhǎng)，溫度在32℃以上的時(shí)候生長(zhǎng)速度則明顯減緩，甚至枯萎直至死亡[2]。目前，我國(guó)僅產(chǎn)車前屬Plantago，約18種，在世界范圍內(nèi)證明是車前科的有3屬，約270種[3]。迄今為止，車前草已被分離出60余種化合物，如多糖類、黃酮及其苷類、三萜及甾體類和揮發(fā)油類等[4]。車前草最開始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為藥草中的上品，全草和種子均可藥用[5]，具有抑菌抗氧化、清熱明目、燥濕止瀉、涼血止血和退熱止痛的功效[6]。

海魚營(yíng)養(yǎng)豐富，也是微生物生長(zhǎng)繁殖的良好的基質(zhì)。馮敬賓等研究表明海水魚類的皮膚、腸道和鰓的表面上細(xì)菌組成中常見優(yōu)勢(shì)菌屬多為假單胞菌、桿菌、弧菌、球菌和無(wú)色菌[7]，因此抑制此類菌的生長(zhǎng)是海魚保鮮的首要考慮。因化學(xué)保鮮劑有毒副作用，低溫保藏需制冰增加運(yùn)輸成本，因此生物保鮮成為研究的熱點(diǎn)。生物保鮮技術(shù)具有便捷高效、健康安全、天然無(wú)害、毒副作用小或無(wú)毒副的保鮮作用等優(yōu)勢(shì)，因此，生物保鮮劑代替化學(xué)保鮮劑不僅可以延長(zhǎng)海魚的保質(zhì)期，更加保障了食品的安全[8]。本實(shí)驗(yàn)研究車前草不同醇提取液對(duì)九種常見魚體上的細(xì)菌的抑菌效果，為車前草制成植物保鮮劑，減少細(xì)菌對(duì)魚體的污染，延長(zhǎng)海魚的保鮮時(shí)間提供有效依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)材料。車前草干草（Plantago asiatica L.）從海南省三亞市荔枝溝市場(chǎng)購(gòu)買，符合《中國(guó)藥典》2015年版，產(chǎn)地江西。

（2）菌種。副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、熒光假單胞菌（P.Fluorescens）、腐敗希瓦氏菌（Shewanellaputre faciens）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter sp）、大腸埃希氏菌（E.coli）、沙門氏傷寒桿菌（Salmonella enteric）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、普通變形桿菌（Proteusvulgaris），實(shí)驗(yàn)菌種均購(gòu)買于廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司。

（3）菌種活化。用營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成斜面，將復(fù)蘇液或無(wú)菌水加入菌粉中，搖勻后用移液槍吸取液體接種菌種到配制好的斜面中，于37±2℃培養(yǎng)，復(fù)蘇后的菌種宜傳代培養(yǎng)2～3次。將活化好的菌種保存在0～4℃的冰箱中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）車前草提取液的制備。用電子天平秤取400g烘干后的車前草分裝，分別加入無(wú)水乙醇、90%乙醇和80%乙醇溶液各1000mL并浸泡12h，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至乙醇或水完全被蒸發(fā)后，用超純水洗出提取物配制成1g/mL溶液備用，再用超純水配出0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL的樣液[9]。

（2）抑菌活性的測(cè)定。采用K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)法測(cè)定[10]：用打孔器在濾紙上剪取6mm的圓形紙片。將車前草醇提取液樣液浸泡無(wú)菌紙片1h，揮干即用。用比濁法配成菌懸液為1×106～1×107c fu[11]，用移液槍吸取0.2mL供試菌懸液注入到固體培養(yǎng)基表面，用涂布器涂勻，每個(gè)樣品對(duì)每種測(cè)試菌做三個(gè)重復(fù)。在恒溫培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng)36h后，觀察抑菌圈大小并用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑（包括紙片的6mm），取幾何平均值[12]。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0版處理數(shù)據(jù)。

2 車前草醇提取液的抑菌作用

2.1 車前草無(wú)水乙醇提取液的抑菌作用

由表1可知，車前草無(wú)水乙醇提取液在設(shè)為不同濃度的情況下，對(duì)同一種細(xì)菌都有極顯著的抑制作用（P<0.01）。當(dāng)濃度為0.25g/mL時(shí)，僅對(duì)沙門氏傷寒桿菌和金黃色葡萄球菌有低抑制作用。當(dāng)濃度為0.50g/mL時(shí)，對(duì)副溶血性弧菌、熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、沙門氏傷寒桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果顯著提高。當(dāng)濃度為0.75g/mL時(shí)，抑制均有效果且達(dá)到最大，其中對(duì)腐敗希瓦氏菌、無(wú)色桿菌屬、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌均達(dá)到中抑菌水平，抑菌圈的直徑略大于10mm，相對(duì)于沙門氏傷寒桿菌和熒光假單胞菌有非常顯著的差異性?？傮w來(lái)說(shuō)此提取液對(duì)沙門氏傷寒桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果較好。

表1 車前草無(wú)水乙醇提取液提取液抑菌圈的大小

2.2 車前草90%乙醇提取液的抑菌作用

由表2可知，車前草90%乙醇提取液在設(shè)為不同濃度的情況下，對(duì)同一種細(xì)菌都有極顯著的抑制作用（P<0.01）。當(dāng)濃度為0.25g/mL時(shí)，僅對(duì)金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和糞腸球菌有抑制效果且作用強(qiáng)烈。當(dāng)濃度為0.50g/mL時(shí)，對(duì)副溶血性弧菌、腐敗希瓦氏菌、沙門氏傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和普通變形桿菌抑制效果顯著提升，其中糞腸球菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈大小已達(dá)到17mm以上。當(dāng)濃度為0.75g/mL時(shí)，抑制均有效果且達(dá)到最大，腐敗希瓦氏菌、沙門氏傷寒桿菌和普通變形菌的抑菌圈在10～15mm之間，有中抑菌活性；糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈竟高達(dá)19mm以上，有高抑菌活性，且對(duì)無(wú)色桿菌屬、熒光假單胞菌和副溶血性弧菌的差異最顯著?？傮w來(lái)說(shuō)此提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌抑制效果非常強(qiáng)烈。

表2 車前草90%乙醇提取液的抑菌作用

2.3 車前草80%乙醇提取液的抑菌作用

由表3可知，車前草80%乙醇提取液在設(shè)為不同濃度的情況下，對(duì)同一種細(xì)菌都有極顯著的抑制作用（P<0.01）。當(dāng)濃度為0.25g/mL時(shí)，對(duì)九種細(xì)菌均表現(xiàn)出抑制效果，大腸埃希氏菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌抑制作用高于其他六種菌。當(dāng)濃度為0.50g/mL時(shí)，隨著濃度提高，對(duì)九種細(xì)菌的抑制效果也隨之上升。當(dāng)濃度為0.75g/mL時(shí)，抑制效果達(dá)到最大，對(duì)腐敗希瓦氏菌、沙門氏傷寒桿菌和金黃色葡萄球菌有中等抑菌活性，抑菌圈大小在10～15mm之間；對(duì)大腸埃希氏菌和糞腸球菌有高抑菌活性，抑菌圈大小在17mm以上，對(duì)無(wú)色桿菌屬、副溶血性弧菌和熒光假單胞菌的差異最顯著?？傮w來(lái)說(shuō)此提取物對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制效果非常強(qiáng)烈。

表3 不同濃度車前草80%乙醇提取液抑菌圈的大小

2.4 車前草不同濃度醇提取液對(duì)不同細(xì)菌作用的菌落數(shù)比較

由表4可以得知醇提取液對(duì)九個(gè)菌株總體來(lái)說(shuō)有不同程度的抑制效果，而且隨著濃度的提高抑菌效果也隨著增強(qiáng)。當(dāng)濃度≥0.75g/mL時(shí)，三種醇提取液均對(duì)九種菌有抑制效果。其中，無(wú)水乙醇對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果比較好；90%車前草醇提取液對(duì)沙門氏傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌和糞腸球菌表現(xiàn)強(qiáng)抑制作用；80%車前草醇提取液對(duì)腐敗希瓦氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏傷寒桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果強(qiáng)烈。當(dāng)濃度≥0.50g/mL和≥0.25g/mL時(shí)，只有80%車前草醇提取液對(duì)九種菌都有抑制效果，而90%車前草醇提取液和無(wú)水乙醇提取液僅對(duì)幾種菌能有抑制作用。

表4 車前草不同濃度醇提取液對(duì)不同細(xì)菌作用的菌落數(shù)比較

3 結(jié)論

車前草的四種提取液對(duì)九種菌都有不同的抑制作用。車前草醇提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌菌株均有不同程度的抑制作用，80%車前草醇提取液>90%車前草乙醇提取液>無(wú)水乙醇提取液，這與孔陽(yáng)研究車前草的不同濃度乙醇提取液具有較強(qiáng)的抑菌效果相似[13]。柴明艷研究車前草的內(nèi)生菌的活性產(chǎn)物得出對(duì)金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等的抑菌效果不錯(cuò)[14]，此與實(shí)驗(yàn)中得出的四種提取液對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和普通變形桿菌的抑制效果好的結(jié)論相似。經(jīng)研究表明魚類身體自帶的致病菌主要有假單胞菌屬、無(wú)色菌屬、弧菌和球菌等；在運(yùn)輸過(guò)程中還會(huì)污染有大腸桿菌、變形桿菌、希瓦氏菌等腐敗細(xì)菌[15]，由此推斷，車前草提取液可以有效抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和普通變形桿菌在海魚上的生長(zhǎng)繁殖，但其對(duì)副溶血性弧菌、熒光假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、無(wú)色桿菌屬和沙門氏傷寒桿菌的抑制效果不強(qiáng)，因此車前草可以與其它中草藥配伍進(jìn)行強(qiáng)化殺菌。綜合車前草的殺菌作用得出，車前草提取物對(duì)海魚運(yùn)輸中污染細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖有一定的抑制效果，可以延長(zhǎng)捕撈后的海魚的保質(zhì)期。