仿生礦化角蛋白多孔材料的制備及性能研究

季 吉，陳 光，李麗麗，袁久剛，苑 超，王 平，許 波

(江南大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

近年來多孔材料因其密度低、孔隙率高、比表面積高及重量輕等特點(diǎn)在組織工程、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用[1-4]。但目前大多數(shù)多孔材料以人工合成材料為主，如金屬材料、無機(jī)質(zhì)多孔材料等，其生物相容性有所欠缺。而生物相容性對(duì)多孔材料的應(yīng)用具有重要影響。

為解決這一問題，研究者將目光投向了蛋白質(zhì)類高分子材料。以絲蛋白、膠原蛋白以及角蛋白為代表的天然蛋白高分子不但來源豐富，而且具有生物相容性好及可生物降解等優(yōu)點(diǎn)。在這3種蛋白質(zhì)中，角蛋白來源最為豐富，而且在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有獨(dú)特的RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)氨基酸序列[5-6]，這賦予了其更好的生物相容性。但是角蛋白分子間存在特殊的二硫鍵結(jié)構(gòu)，其溶解和提取非常困難[7-9]。此外，角蛋白再生材料力學(xué)性能較差，存在著脆性強(qiáng)、彈性差、強(qiáng)力低等缺點(diǎn)，與天然角蛋白的優(yōu)良性能完全無法比擬。為提升角蛋白多孔材料的力學(xué)性能，研究者通常采用的手段有物理共混[10-11]、化學(xué)改性[12-13]及改變成孔方法[14]等。近年來，為了進(jìn)一步拓寬蛋白質(zhì)生物材料或醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，不少研究者還對(duì)多孔材料進(jìn)行仿生礦化處理，即通過模擬體液法、交替礦化法或過飽和鈣化溶液浸泡法等[15]，在材料表面形成羥基磷灰石(HAP)。HAP是自然界中天然存在的礦物質(zhì)，具有良好的生物相容性和生物活性，在藥物緩釋[16]、基因傳遞[17]、組織工程[18]等領(lǐng)域均有應(yīng)用。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，利用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)制備了聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)改性角蛋白，再與海藻酸鈉(SA)共混，利用冷凍干燥法制備了多孔材料。最后，利用交替浸泡法在材料表面沉積HAP，實(shí)現(xiàn)了角蛋白多孔材料的仿生礦化，以期改善角蛋白多孔材料的力學(xué)性能，同時(shí)更好地保護(hù)其生物相容性。詳細(xì)研究了角蛋白改性后所制備的多孔材料的力學(xué)性能、表面形貌、生物相容性、金屬離子吸附能力等，這對(duì)探索其在生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景具有較好的啟示意義。

1 材料與方法

1.1 角蛋白的溶解和提取

將脫脂羊毛剪碎后，加入到尿素-氯化膽堿低共熔體系中，添加一定量的還原劑TCEP后，在125 ℃、N2保護(hù)下磁力攪拌5 h來溶解和提取羊毛角蛋白。完全溶解后，將上述角蛋白溶液在去離子水中透析3 d，最后用30%PEG20000溶液濃縮至一定濃度。

1.2 角蛋白多孔材料的制備

將濃縮至50 g/L的角蛋白溶液先于-20 ℃下冷凍24 h，然后于-50 ℃下冷凍干燥48 h，得到純角蛋白多孔材料，再用乙醇醇化，最終得到純角蛋白多孔材料(KR)。

對(duì)照樣PEGDMA/SA多孔材料制備方法與純角蛋白多孔材料制備方法一致，其溶液由去離子水、2.5%PEGDMA和一定量40 g/L的SA組成。

角蛋白與PEGDMA以及SA的混合物多孔材料(KR/PEGDMA/SA)制備方法與純角蛋白多孔材料制備方法一致，其溶液由50 g/L的角蛋白溶液、2.5%PEGDMA和一定量40 g/L的SA組成。

PEGDMA改性角蛋白與SA的混合物多孔材料(PEG-g-KR/SA)制備方法與純角蛋白多孔材料制備方法一致，其溶液由50 g/L的角蛋白溶液、2.5%PEGDMA、1%的環(huán)偶氮脒類引發(fā)劑以及一定量40 g/L的SA組成。

1.3 角蛋白多孔材料的礦化

采用交替礦化法對(duì)角蛋白多孔材料表面進(jìn)行礦化。分別將KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA浸泡于37 ℃的CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2濃度為500 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為7.5)中30 min，用去離子水沖洗后，再浸泡于37 ℃的Na2HPO4/Tris-HCl溶液(Na2HPO4濃度為300 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為8.5)中30 min，最后用去離子水沖洗。上述步驟為一個(gè)周期，重復(fù)5個(gè)周期后冷凍干燥。

1.4 紅外測(cè)試

采用Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。

1.5 物相分析

使用D8型X射線衍射儀(德國(guó)布魯克AXS有限公司)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試條件為：CuKα靶(λ=0.154 nm)，電壓40 kV，電流30 mA，步長(zhǎng)0.05°，掃描速度2°/min，掃描范圍5°～40°。

1.6 表面形貌觀察

將多孔材料樣品噴金后，采用Hitachi SU1510掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)觀察表面形貌，放大倍數(shù)為100和5 000倍。

1.7 力學(xué)性能測(cè)試

采用MIT-1萬能測(cè)試儀(江蘇省常州市三豐儀器科技有限公司)對(duì)樣品進(jìn)行壓縮性能測(cè)試，壓縮速率為0.5 mm/min。

1.8 生物相容性測(cè)試

采用MTT法對(duì)樣品進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測(cè)試。先將500 μL 3T3細(xì)胞懸液加入到有樣品的孔板中(細(xì)胞接種密度約5×103個(gè)/孔)，空白對(duì)照組僅加入細(xì)胞而不加樣品。將接種了細(xì)胞的培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，向含有細(xì)胞的孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，隨后吸掉MTT溶液，再加入100 μL DMSO顯色。最后，使用Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下不同細(xì)胞培養(yǎng)板里每孔的吸光度值，每個(gè)樣品進(jìn)行5組平行試驗(yàn)。按如下公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：

細(xì)胞存活率=A1/A0×100%

其中：A1為實(shí)驗(yàn)組樣品的吸光度；A0為空白對(duì)照樣品的吸光度。

1.9 Cu2+吸附測(cè)試

將樣品分別加入到初始質(zhì)量濃度為900 mg/L、pH 5.5的Cu2+溶液中，在25 ℃、150 r/min的恒溫振蕩器中振蕩一定時(shí)間后，取上層清液，加入稍過量的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)，形成藍(lán)色的EDTA-Cu絡(luò)合物，利用UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)在735 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔材料的產(chǎn)品外觀

通過冷凍干燥法制備的多孔材料外觀完整，呈圓柱形。純角蛋白多孔材料(KR)表面有許多大而不規(guī)則的孔隙，其質(zhì)地非常脆且易碎；對(duì)照樣PEGDMA/SA多孔材料的彈性較好，但是強(qiáng)力較低，在外界壓力下很容易變形。KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA兩種多孔材料的孔隙都小而密，其硬度和彈性均有所提升；經(jīng)過仿生礦化，KR/PEGDMA/SA/5 cycles和PEG-g-KR/SA/5 cycles表面均勻地沉積了HAP晶體，材料的整體強(qiáng)度進(jìn)一步提升。多孔材料中的外觀形貌見圖1。

圖1 多孔材料的外觀形貌

2.2 角蛋白多孔材料性質(zhì)分析

2.2.1 紅外測(cè)試

圖2 角蛋白多孔材料的紅外譜圖

2.2.2 XRD分析

在KR的XRD譜圖(圖3)中，2θ=10°和2θ=20°左右的特征峰分別代表了角蛋白的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，其衍射峰非常明顯；與PEGDMA共混或接枝后，2θ=10°附近的衍射峰明顯減小，表明α-螺旋含量減少，這是由于分子間氫鍵作用力的增強(qiáng)，破壞了角蛋白α-螺旋的有序結(jié)構(gòu)。

圖3 角蛋白多孔材料的XRD圖

經(jīng)過礦化，角蛋白的α-螺旋和β-折疊特征峰幾乎消失，KR/PEGDMA/SA/5 cycles和PEG-g-KR/SA/5 cycles都在2θ=26.3°(晶面002)和2θ=31.8°(211)處有明顯的HAP衍射峰[21]，并且，PEG-g-KR/SA/5 cycles在2θ=32.9°(300)，2θ=34.1°(202)和2θ=39.4°(310)處的衍射峰面積更大，測(cè)試結(jié)果與純HAP的XRD數(shù)據(jù)相符，由此可以推測(cè)，礦化后PEG-g-KR/SA表面生成了更多的HAP。

2.2.3 表面形貌觀察

純角蛋白多孔材料[圖4(a1)和(b1)]的表面非常光滑、平整，PEG-g-KR/SA表面則可以觀察到孔狀結(jié)構(gòu)，說明與PEG接枝后角蛋白有更好的成孔能力。礦化后，多孔材料表面變得粗糙，有顆粒狀無機(jī)物生成，表明HAP成功沉積于角蛋白多孔材料表面。PEG-g-KR/SA/5 cycles表面生成的顆粒物體積比KR/PEGDMA/SA/5 cycles表面的更小、更多，且分布更為均勻[圖4(a2)和(b2)]，這是因?yàn)镻EG-g-KR/SA的比表面積更大，沉積位點(diǎn)更多，有利于HAP沉積。

圖4 角蛋白多孔材料的表面形貌(100倍、5 000倍)

2.2.4 力學(xué)性能測(cè)試

純角蛋白多孔材料(KR)表現(xiàn)出很強(qiáng)的脆性，當(dāng)應(yīng)變達(dá)到16%時(shí)，材料就已經(jīng)完全破碎。對(duì)照物PEGDMA/SA多孔材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線幾乎為一條直線，說明不含角蛋白的多孔材料沒有剛性。KR/PEGDMA/SA的屈服點(diǎn)應(yīng)力為0.57 MPa，且表現(xiàn)為塑性，在其應(yīng)力-應(yīng)變曲線上有一段屈服平臺(tái)，屈服平臺(tái)越長(zhǎng)，材料抗破壞的能力越強(qiáng)。PEG-g-KR/SA則表現(xiàn)為典型的彈性材料，其屈服點(diǎn)應(yīng)力為1.2 MPa，說明與PEG接枝制備的角蛋白多孔材料既有良好的彈性又有一定的剛性。見圖5。

圖5 角蛋白多孔材料的應(yīng)力應(yīng)變曲線

經(jīng)過礦化，KR/PEGDMA/SA和PEG-g-KR/SA的屈服點(diǎn)應(yīng)力分別增大至2.7 MPa和3.1 MPa，并且仍然分別表現(xiàn)為塑性和彈性材料。仿生礦化在保持角蛋白多孔材料原本性能的同時(shí)，進(jìn)一步提升了多孔材料的力學(xué)性能。

2.2.5 生物相容性測(cè)試

純角蛋白(KR)上細(xì)胞存活率約為96.2%，大于PEGDMA/SA上的94.53%，PEG-g-KR/SA多孔材料的細(xì)胞存活率(117.78%)大于KR/PEGDMA/SA多孔材料(100.44%)，礦化后細(xì)胞存活率則進(jìn)一步提升。這說明角蛋白有助于提升多孔材料的生物相容性，與PEG接枝后的角蛋白多孔材料無細(xì)胞毒性，且生物相容性大大提升。礦化后的角蛋白多孔材料的細(xì)胞存活率略高于礦化前，可見多孔材料表面沉積的HAP有利于細(xì)胞的附著與增殖。見圖6。

* 為P<0.05。

2.2.6 Cu2+吸附測(cè)試

角蛋白多孔材料對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)的吸附能力，其吸附量隨時(shí)間增加而上升(圖7)。前6 h內(nèi)，PEG-g-KR/SA/5 cycles吸附速率最快，KR/PEGDMA/SA吸附速率最慢；吸附10 h后，吸附速率達(dá)到平衡，其24 h的吸附量分別為142.4 mg/g(KR/PEGDMA/SA)、155.6 mg/g(KR/PEGDMA/SA/5 cycles)、147.1 mg/g(PEG-g-KR/SA)和159.0 mg/g(PEG-g-KR/SA/5 cycles)。該結(jié)果表明，PEG改性角蛋白多孔材料對(duì)Cu2+的吸附能力強(qiáng)于物理共混的角蛋白多孔材料，經(jīng)過礦化后，角蛋白多孔材料對(duì)Cu2+的吸附能力進(jìn)一步提高。這是由于接枝制備的多孔材料中角蛋白與PEGDMA、SA的排列更緊密有序，有更多穩(wěn)定的羧基、羥基結(jié)構(gòu)可以與銅離子絡(luò)合。而礦化后，在材料表面沉積的HAP中含有易和金屬離子發(fā)生置換的Ca2+，因此可以吸附更多的Cu2+。

(a)Cu2+標(biāo)準(zhǔn)曲線;(b)24 h吸附曲線。

3 結(jié)論

通過巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備的PEG改性角蛋白多孔材料具有良好的彈性和剛性，其力學(xué)性能、生物相容性均比純角蛋白多孔材料優(yōu)異。經(jīng)過仿生礦化，多孔材料表面生成了體積更小、分布更均勻的HAP，這進(jìn)一步提升了角蛋白多孔材料的力學(xué)性能和生物相容性。而且本文制備的多孔材料對(duì)Cu2+有較好的吸附作用，其24 h吸附量高達(dá)159.0 mg/g。這對(duì)擴(kuò)展角蛋白多孔材料的應(yīng)用具有較好的啟示意義。