溶酶體與神經(jīng)退行性疾病

曲莉麗，倉春蕾

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230026)

溶酶體是真核細胞內(nèi)發(fā)揮降解功能最主要的細胞器，它含有60多種水解酶，可以降解由內(nèi)吞、自噬等途徑輸送到溶酶體的多種生物大分子和損傷的細胞器，并將降解產(chǎn)物運送到細胞內(nèi)或細胞外重新利用。因此，自從1955年Duve等[1]發(fā)現(xiàn)溶酶體以來，在很長一段時間里溶酶體都被看作是細胞內(nèi)的“回收站”。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了降解功能外，溶酶體還在細胞的營養(yǎng)感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達調(diào)控、細胞死亡、質(zhì)膜修復(fù)、抗原加工和呈遞以及細胞器質(zhì)量控制等過程中發(fā)揮重要作用[2]。因此，溶酶體的功能異常對細胞和機體有多方面的影響，也和多種疾病密切相關(guān)，如溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病、炎癥、自身免疫疾病、腫瘤等[3]。

溶酶體貯積癥是一大類由于溶酶體相關(guān)基因突變引起的單基因遺傳性疾病，目前已知的相關(guān)基因有70多個，這些基因編碼溶酶體酶、溶酶體膜蛋白或溶酶體功能調(diào)控因子，它們的突變會導(dǎo)致溶酶體功能異常，引起降解底物在溶酶體中大量積累，最終導(dǎo)致細胞功能障礙和細胞死亡[4]。根據(jù)貯積物和病理特征的不同，溶酶體貯積癥可以分為不同的類型。常見的溶酶體貯積癥有戈謝氏病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、尼曼匹克病(Niemann-Pick disease)、黏脂質(zhì)貯積癥(mucolipidosis)、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronal ceroid lipofuscinosis)等。由于神經(jīng)元對溶酶體貯積更為敏感，而且神經(jīng)元是終末分化的細胞，一旦死亡后無法得到有效的補充，因此大部分溶酶體貯積癥都出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的癥狀，這一現(xiàn)象也將溶酶體與神經(jīng)退行性疾病聯(lián)系起來[5]。

神經(jīng)退行性疾病是一類由神經(jīng)元結(jié)構(gòu)或功能逐漸喪失甚至死亡而引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的疾病，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓病(Huntington’s disease，HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronal ceroid lipofuscinosis，NCL)、額顳葉癡呆(frontotemporal lobar dementia，F(xiàn)LTD)等多種類型。除了少數(shù)家族性神經(jīng)退行性疾病有明確的致病基因外，大多數(shù)疾病的發(fā)病機制尚不清楚，因此缺乏有效的治療手段[6]。

近年來，隨著研究的逐步深入，越來越多的證據(jù)表明溶酶體功能異常與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。首先，在很多神經(jīng)退行性疾病的病人中都發(fā)現(xiàn)了溶酶體功能的改變。有統(tǒng)計顯示在英國兒童發(fā)生的神經(jīng)退行性疾病中，約有45%的病人存在溶酶體功能異常[7]。其次，針對神經(jīng)退行性疾病的基因組關(guān)聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)了多個溶酶體相關(guān)基因，進一步確認了溶酶體與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系[8-9]。另外，神經(jīng)退行性疾病中常出現(xiàn)物質(zhì)的異常累積，也提示作為細胞“回收站”的溶酶體的降解功能可能出現(xiàn)了異常。最后，溶酶體還被發(fā)現(xiàn)是衰老的重要調(diào)控位點，而衰老是多種神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵誘發(fā)因素[10]。因此，研究溶酶體功能異常在神經(jīng)退行性疾病中的作用，有助于進一步解析神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制，也有望為疾病的治療和藥物開發(fā)提供新的靶點。

溶酶體功能異常可能是由多方面因素導(dǎo)致的，如溶酶體酶的表達和活性改變、溶酶體pH穩(wěn)態(tài)失衡、離子通道或其他溶酶體膜蛋白功能異常、溶酶體定位異常等，這些因素與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系也得到了廣泛研究。

1 溶酶體酶

溶酶體的降解功能是由60多種溶酶體酶完成的，這些酶包括糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、酯酶等不同類型，分別負責(zé)特定底物的分解代謝。除了降解功能外，溶酶體酶在蛋白質(zhì)加工、溶酶體穩(wěn)態(tài)維持、細胞凋亡以及免疫應(yīng)答等生理過程中都發(fā)揮至關(guān)重要的作用。溶酶體酶的功能缺陷可導(dǎo)致相應(yīng)的底物無法降解從而在溶酶體中大量積累，引起細胞代謝和胞內(nèi)信號通路紊亂，進而導(dǎo)致溶酶體貯積癥[4]。這些溶酶體貯積癥中有很多種都表現(xiàn)出神經(jīng)病理學(xué)癥狀[5]。

事實上，在常見的神經(jīng)退行性疾病中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)溶酶體酶活性的改變。在眾多的溶酶體酶中，組織蛋白酶cathepsin是最受關(guān)注的類型，它與衰老和神經(jīng)退行性疾病關(guān)系也被逐步揭示出來。衰老的一個重要特征是蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)失衡，而負責(zé)降解蛋白質(zhì)和多肽的cathepsin的功能異常則是引起蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡和衰老的重要原因[11]。cathepsin有多種不同的類型，可以分為3個亞群：絲氨酸蛋白酶，包括cathepsin A和G；天冬氨酸蛋白酶，包括cathepsinD和E；半胱氨酸蛋白酶，包括cathepsin B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W。在這些酶中有很多種都與衰老和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)在衰老大鼠的腦組織中，cathepsin L的蛋白水平未改變，但其活性卻顯著降低[12]。另一項研究則發(fā)現(xiàn)cathepsin B也存在類似的情況[13]。cathepsin B和L對小鼠出生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，這兩種酶缺失的小鼠出現(xiàn)腦內(nèi)特定神經(jīng)元的大量凋亡并表現(xiàn)出一定程度的腦萎縮[14]。與B和L不同的是，cathepsin D和E在衰老的大鼠和人的多個腦區(qū)中均出現(xiàn)表達水平和活性的升高[12,15]，這可能還與衰老神經(jīng)細胞中脂褐質(zhì)的積累有關(guān)[16]。

與溶酶體酶最直接相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病是神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(NCL)。NCL是一類早發(fā)型神經(jīng)退行性疾病，大部分患者在嬰幼兒期發(fā)病，癥狀包括癡呆、失明、腦萎縮、癲癇、早亡等，細胞學(xué)特征為自發(fā)熒光脂褐質(zhì)和ATP合酶亞基C在溶酶體的積累，因此也是溶酶體貯積癥的一種[17]。NCL疾病是由十幾種CLN基因的突變導(dǎo)致的，其中CLN1、CLN2、CLN10和CLN13基因均編碼溶酶體酶。CLN1基因編碼溶酶體酶PPT1(palmitoyl protein thioesterase-1)，這種酶負責(zé)從蛋白質(zhì)的半胱氨酸位點上切割長鏈脂肪酸殘基。CLN2基因編碼溶酶體酶TPP1(tripeptidyl peptidase 1)，它本身是無活性的酶原，在溶酶體中活化，負責(zé)將蛋白和多肽切割為三肽。CLN10和CLN13基因分別編碼cathepsin D和F，因此這兩種蛋白也被稱為CLN10和CLN13[18]。

多種常見神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志性蛋白是溶酶體酶的降解底物或產(chǎn)物，如β-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)、α-突觸核蛋白(α-synuclein)、亨廷頓蛋白(huntingtin)等，而溶酶體酶的異常，尤其是組織蛋白酶的表達和活性改變也常見于這些疾病中。

阿爾茨海默病(AD)是最常見神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為進行性的認知功能障礙和行為損害，包括記憶障礙、語言和運動能力減退、人格和行為異常等多方面癥狀。這些癥狀主要是由于大量神經(jīng)元死亡及神經(jīng)突觸的丟失引起的，但其機制尚不完全清楚。腦中Aβ積累產(chǎn)生的淀粉樣斑塊和Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的典型病理特征，也被認為是引起神經(jīng)細胞死亡的可能原因[19]。Aβ是由β-secretase和γ-secretase這兩種酶對APP(amyloid precursor protein)蛋白進行切割產(chǎn)生的，而溶酶體被認為是切割的主要位點之一[20]。β-secretase的活性在pH 4.5左右，是溶酶體的pH值[21]。γ-secretase需要和AD相關(guān)蛋白Presenilin 1(PS1)及其他幾個蛋白組成復(fù)合體發(fā)揮酶切活性[22]。PS1編碼基因的突變是導(dǎo)致家族性AD的最主要原因，而且PS1突變也會影響自噬流以及溶酶體酶的活性[23]。

一些溶酶體酶可能與Aβ的生成及降解相關(guān)，如cathepsin B和D，但相關(guān)的研究存在較大爭議。早期研究發(fā)現(xiàn)AD病人中cathepsin D的表達和活性均有所上升，并且存在于淀粉樣斑塊中[24-25]，因此認為cathepsin D和AD相關(guān)。研究表明cathepsin D基因的核苷酸多態(tài)性與AD的發(fā)病率相關(guān)[26]，但隨后一些研究卻不支持這一觀點[27-28]。cathepsin D也被認為具有類似于β和γ-secretase類似的切割A(yù)PP的活性[29]，但也有研究在cathepsin D缺陷的海馬神經(jīng)元中并未發(fā)現(xiàn)APP切割的異常[30]。除了Aβ外，Tau蛋白也可能與cathepsin D相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)cathepsin D的抑制劑可以抑制AD中Tau的過度磷酸化現(xiàn)象[31]。cathepsin B最早被認為可以有效降解Aβ[32-33]，但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制cathepsin B反而可以降低Aβ的積累并改善AD模型小鼠的記憶[34]。總之，AD和cathepsin的關(guān)系還有待進一步研究。

帕金森病(PD)是僅次于AD第二高發(fā)的神經(jīng)退行性疾病，主要癥狀為震顫麻痹。PD的發(fā)病原因為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡，但除了少部分家族性PD是由幾種相關(guān)基因突變引起的之外，大部分散發(fā)型PD的發(fā)病機制目前尚不清楚[35]。α-突觸核蛋白的積累和路易小體(Lewy bodies)的出現(xiàn)是PD的典型病理特征，提示蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)異常。cathepsin D是降解α-突觸核蛋白的最主要的溶酶體酶[36]。cathepsin D缺陷小鼠的腦中出現(xiàn)α-突觸核蛋白的過度積累，而過表達cathepsin D的細胞則可以促進α-突觸核蛋白的降解并減輕其帶來的毒性[37-38]。除了cathepsin D外，也有研究提示cathepsin B和L和α-突觸核蛋白的沉積或降解相關(guān)[39]。

亨廷頓病(HD)是一種huntingtin基因突變導(dǎo)致的遺傳性神經(jīng)退行性疾病，癥狀包括運動協(xié)調(diào)和認知受損、肌張力障礙以及舞蹈樣動作等，因此也常被稱為亨廷頓舞蹈癥。Huntingtin基因編碼的Huntingtin蛋白是cathepsin D、B和L的底物，這些酶參與Huntingtin蛋白的加工[40]。正常的亨廷頓蛋白可以被cathepsin D降解，但突變的亨廷頓蛋白則對cathepsin D有更高的抗性[41]。在亨廷頓病人腦組織中發(fā)現(xiàn)cathepsin D活性的增加，這一現(xiàn)象在體外細胞實驗中也得到驗證[41-42]。這種活性增強可能并不是促進疾病發(fā)生的因素，因為有研究發(fā)現(xiàn)過表達cathepsin B和D在HEK293細胞及原代培養(yǎng)神經(jīng)元中均表現(xiàn)出神經(jīng)保護的作用[43]。

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又叫運動神經(jīng)元病或“漸凍病”，主要癥狀為進行性運動神經(jīng)元丟失及肌無力和肌萎縮，導(dǎo)致病人在發(fā)病后3～5年內(nèi)死亡。大部分ALS病人的發(fā)病機制目前尚不清楚。在ALS模型小鼠的脊髓中，cathepsins B、L、D和S的表達均有明顯上升[44-45]，而在ALS病人中則僅有cathepsins B和D出現(xiàn)表達上調(diào)[46]。

除了組織蛋白酶外，其他溶酶體酶的異常也在神經(jīng)退行性疾病中被發(fā)現(xiàn)。如在散發(fā)型帕金森病人腦組織中β-葡糖腦苷脂酶(β-glucocerebrosidase)的表達水平和酶活性的降低，并與溶酶體分子伴侶介導(dǎo)自噬的減少、α-突觸核蛋白的異常積累以及神經(jīng)酰胺的減少直接相關(guān)[47]。β-葡糖腦苷脂酶編碼基因GBA1的突變本身就是帕金森病和路易體癡呆病的危險因素，也是最常見的一種溶酶體貯積癥——戈謝氏病(Gaucher’s disease)的主要誘發(fā)因素[48]。另一項研究在帕金森病人腦脊液中也發(fā)現(xiàn)β-葡糖腦苷脂酶活性的降低，同時發(fā)現(xiàn)另一個溶酶體酶β-己糖胺酶(β-Hexosaminidase)的活性反而升高了。而在亨廷頓舞蹈病患者的腦脊液中則發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶(acid phosphatase)的活性增高，且與年齡正相關(guān)[49]。

這些研究表明神經(jīng)退行性疾病與溶酶體酶功能異常相關(guān)(表1)，因此溶酶體酶逐漸成為這些疾病藥物開發(fā)的新靶點。一些針對溶酶體酶的替代療法已經(jīng)得到臨床應(yīng)用，大量的小分子藥物也在開發(fā)中，有望為神經(jīng)退行性疾病的治療和藥物開發(fā)帶來新的曙光[50-51]。

表1 神經(jīng)退行性疾病與相關(guān)的溶酶體酶

2 溶酶體pH和V-ATPase

大多數(shù)溶酶體酶是酸性水解酶，因此溶酶體腔內(nèi)需要維持pH值為4.5～5.0的酸性環(huán)境[52]。這種酸性環(huán)境還是溶酶體鈣離子儲存、囊泡運輸、營養(yǎng)感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及維持溶酶體完整性的基本條件，對溶酶體的功能至關(guān)重要。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)溶酶體酸化改變是衰老的重要調(diào)控因子[53]。如多項酵母中的研究發(fā)現(xiàn)衰老過程常常伴隨著溶酶體pH值的升高，加強溶酶體酸化是酵母復(fù)制壽命延長的關(guān)鍵因素之一[54-55]。而在人類中，溶酶體酸化缺陷已被發(fā)現(xiàn)與多種神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[56]，恢復(fù)溶酶體pH被認為是治療這些疾病的重要策略。如Coffey等[57]發(fā)現(xiàn)在PS1突變引起的家族性AD患者的皮膚成纖維細胞中，溶酶體 pH 值有小幅度但顯著的增加，并伴有溶酶體內(nèi)成熟組織蛋白酶D及其活性位點水平的降低以及自噬底物的大量積累。一些與神經(jīng)退行性疾病的致病基因編碼的蛋白也被證明與溶酶體pH調(diào)控相關(guān)，如帕金森病(PD)相關(guān)蛋白LRRK2(leucine rich repeat kinase 2)、TMEM175(transmembrane protein 175)、ATP13A2(ATPase cation transporting 13A2)[56,58-59]，額顳葉型癡呆(FTD)相關(guān)蛋白TMEM106B(transmembrane protein 106B)[60]、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)相關(guān)蛋白UBQLN2(ubiquilin 2)等[61]，這或許是這些疾病中溶酶體功能異常的潛在機制。

溶酶體酸化主要是靠溶酶體膜上的質(zhì)子泵V-ATPase實現(xiàn)的，它通過水解ATP產(chǎn)生能量將胞質(zhì)側(cè)的H+泵入溶酶體腔內(nèi)[52]。V-ATPase是一種復(fù)雜的多亞基蛋白復(fù)合物，由細胞質(zhì)側(cè)的V1區(qū)和溶酶體膜錨定的V0區(qū)組成。哺乳動物V-ATPase的V1結(jié)構(gòu)域由A～H 8種類型的亞基組成，V0結(jié)構(gòu)域則包括a、c、c′、c″、d、e等6種不同的亞基[62](圖1)。在V1結(jié)構(gòu)域中，3個V1A與3個V1B亞基組成異六聚體介導(dǎo) ATP的結(jié)合和水解，并驅(qū)動由V1D與V1F形成的中央轉(zhuǎn)子亞復(fù)合體的旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致H+逆濃度梯度轉(zhuǎn)運通過V0區(qū)域進入溶酶體腔內(nèi)[62]。

圖1 溶酶體質(zhì)子泵：V-ATPase

研究表明V-ATPase與衰老及多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，它組成亞基的遺傳缺陷可以直接導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。V1B2在大腦中高表達，它的突變會損害溶酶體酸化并導(dǎo)致感覺神經(jīng)性耳聾[63]。V1B1及V0a4亞基功能缺失性突變均會造成嬰幼兒生長遲緩、佝僂病以及神經(jīng)性聽力喪失[64]。V-ATPase還參與視覺功能的正常發(fā)育，V0a3亞基突變會導(dǎo)致人類嚴重的常染色體隱性骨硬化癥，V0a3缺乏的小鼠出現(xiàn)視神經(jīng)管受壓造成視神經(jīng)損傷，在出生2～3周之后即發(fā)生視網(wǎng)膜退化[65]。先天性糖基化病及常染色體隱性皮膚松弛癥與V0a2亞基功能喪失相關(guān)，這些病人往往容易出現(xiàn)大腦發(fā)育異常、智力低下、癡呆、癲癇等癥狀[66]。

除了V-ATPase編碼基因本身的突變外，V-ATPase亞基蛋白的表達水平和穩(wěn)定性改變也是神經(jīng)退行性疾病中的常見現(xiàn)象。如AD相關(guān)蛋白PS1除了在淀粉樣前體蛋白APP生成淀粉樣蛋白Aβ中起重要作用外，還是V-ATPase V0a1 亞基的特定配體，對V-ATPase 靶向溶酶體、溶酶體酸化和自噬過程中的蛋白水解至關(guān)重要[23]。PS1 突變的家族性AD患者細胞和PS1敲除的小鼠細胞均表現(xiàn)出 V0a1 成熟缺陷，同時散發(fā)型AD病人海馬神經(jīng)元中V0a1的mRNA表達也有所降低，引起V-ATPase活性降低、溶酶體pH值升高、水解能力降低，進而引起的自噬功能障礙而無法降解大量聚集的Aβ[23,57,67]。另外，在AD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了V1E1、V1A亞基表達水平的降低[68-69]。PD相關(guān)蛋白LRRK2會結(jié)合V0a1亞基，增強其穩(wěn)定性和表達水平，而LRRK2致病性的突變R1441C會打破它們之間的結(jié)合，降低V0a1的表達，引起溶酶體pH值的升高[59]。FTD/ALS相關(guān)蛋白TMEM106B和UBQLN2也是通過影響V0結(jié)構(gòu)域的表達進而造成溶酶體的嚴重酸化缺陷[60-61]。

3 溶酶體膜蛋白

溶酶體膜上除了上述的質(zhì)子泵外，還有很多其他類型的蛋白質(zhì)，包括離子通道、轉(zhuǎn)運體、結(jié)構(gòu)性蛋白(LAMP、LIMP等)、運輸復(fù)合體原件、膜嵌合的酶以及一些功能尚不清楚的蛋白質(zhì)。這些膜蛋白分別參與不同的溶酶體功能，它們的功能異常會導(dǎo)致溶酶體功能障礙，進而引起多種類型的疾病，同時也與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)(圖2)。

圖2 溶酶體膜蛋白與神經(jīng)退行性疾病

3.1 溶酶體離子通道

溶酶體的氫離子轉(zhuǎn)運會受到其他離子分布的影響，同時溶酶體還是細胞內(nèi)鈣、鐵、鋅等離子的重要儲存位點，因此溶酶體的離子平衡和轉(zhuǎn)運對溶酶體功能至關(guān)重要[70]。溶酶體膜上存在多種類型的離子通道，這些離子通道是調(diào)控溶酶體離子平衡的關(guān)鍵蛋白，其中部分離子通道和神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，包括TRPML1、TMEM175、TPC2和CLC通道等。

TRPML1是溶酶體膜上的一種非選擇性陽離子通道，參與調(diào)控溶酶體的鈣穩(wěn)態(tài)、金屬離子儲存、溶酶體運輸、自噬等[71]。TRPML1的基因突變會導(dǎo)致四型黏脂沉積癥(Mucolipidosis type IV，ML-IV)，這是一種兒童期發(fā)病的神經(jīng)退行性疾病，主要癥狀為智力低下和視網(wǎng)膜退行性病變[72]。在TRPML1功能缺陷的細胞中存在溶酶體脹大、脂類物質(zhì)積累以及溶酶體定位的異常，表明溶酶體降解功能和運輸機制受損[73]。除了ML-IV外，TRPML1也和其他幾種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。在AD的模型中，TRPML1的表達水平降低，進而影響溶酶體內(nèi)的鈣離子釋放及細胞的自噬水平，而過表達或激活TRPML1則會促進β-淀粉樣蛋白的清除，減輕神經(jīng)元的損傷[74-75]。同樣，在ALS的小鼠模型中TRPML1的表達也減少了，藥物激活TRPML1可以減輕運動神經(jīng)元的死亡[76]。此外，在尼曼匹克病中，溶酶體中積累的鞘磷脂也會抑制TRPML1的活性，提示TRPML1可能參與到這一疾病中[77]。

TMEM175是新發(fā)現(xiàn)的一種溶酶體鉀離子通道。鉀離子是溶酶體外最主要的陽離子，因此TMEM175對溶酶體功能有多方面的影響，如溶酶體膜電位、pH以及溶酶體和自噬體的融合[58]。在TMEM175的功能被鑒定之前，它和帕金森病之間的聯(lián)系已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，研究采用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)TMEM175基因的單核苷酸多態(tài)性突變與帕金森病的發(fā)病率及發(fā)病年齡相關(guān)[78-79]，但其機制并不清楚。隨后，采用帕金森病的細胞模型，研究發(fā)現(xiàn)TMEM175的功能缺失會導(dǎo)致溶酶體和線粒體功能缺陷，促進α-突觸核蛋白的積累并增強神經(jīng)元對α-突觸核蛋白的敏感性[80]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)TMEM175可以和AKT組成營養(yǎng)因子敏感的通道復(fù)合體，其與帕金森病相關(guān)的突變則會改變這一通道復(fù)合體的活性，其活性降低或功能缺陷也在細胞和小鼠模型中加劇了帕金森病的病理特征[81]。這些研究提示TMEM175有望成為帕金森病治療和藥物開發(fā)的一個新靶點。

TPC是溶酶體膜上的鈉離子通道，可以和mTOR組成ATP敏感的通道復(fù)合體，參與細胞的能量和營養(yǎng)感知以及溶酶體pH的調(diào)控[82-83]。也有研究發(fā)現(xiàn)TPC通道和NAADP誘發(fā)的溶酶體鈣離子釋放有關(guān)[84]。研究發(fā)現(xiàn)TPC的一個亞型TPC2可能和帕金森病相關(guān)。在攜帶LRRK2的致病性G2019S突變的細胞中存在溶酶體脹大和聚集現(xiàn)象，而敲低或抑制TPC2可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，提示TPC2可能是LRRK2的下游效應(yīng)蛋白，同時也可能成為帕金森病的潛在治療靶點[85]。

除了這些溶酶體陽離子通道外，一些溶酶體陰離子通道也和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，其中包括多個CLC家族蛋白。CLC家族包含多個成員，其中一部分是氯離子通道，另一部分是則是氯離子/氫離子交換器，而且多個CLC成員是定位在內(nèi)體/溶酶體膜上的，包括CLC-3、CLC-4、CLC-5、CLC-6和CLC-7[86]。氯離子被認為是平衡溶酶體氫離子轉(zhuǎn)運引起的電荷積累的反離子，因而這些內(nèi)體溶酶體CLC成員對溶酶體pH的穩(wěn)定至關(guān)重要。CLC-3、CLC-6和CLC-7的功能缺失都會引起神經(jīng)退行性病變。CLC-3的敲除小鼠在出生后很快就表現(xiàn)出嚴重的腦和視網(wǎng)膜的退變，在3個月后它們的海馬腦區(qū)甚至完全丟失[87]。CLC-6敲除小鼠的表型不如CLC-3那么明顯，它們在較大鼠齡時才會出現(xiàn)較弱的腦退變及輕微認知障礙[88]。CLC-6的一個功能增強型突變導(dǎo)致了兒童期早發(fā)的神經(jīng)退行性病變[89]。CLC-7是主要定位于溶酶體的亞型，它的膜定位和正常功能需要輔助亞基Ostm1的幫助[90]。CLC-7及Ostm1的功能缺失都可以導(dǎo)致骨硬化癥(osteopetrosis)，并伴隨有腦和視網(wǎng)膜的退行性病變[88,91]。出乎意料的是，CLC-7/Ostm1敲除小鼠的溶酶體，pH并未受到影響，它們的缺陷引起神經(jīng)退行性病變的機制還有待進一步研究。

3.2 轉(zhuǎn)運體

溶酶體是代謝性細胞器，需要頻繁地進行代謝底物和降解產(chǎn)物跨溶酶體膜的運輸，因此溶酶體膜上存在多種不同類型的轉(zhuǎn)運體蛋白。這些轉(zhuǎn)運體蛋白的功能異常常常和神經(jīng)退行性疾病聯(lián)系起來。ATP13A2(又名PARK9)是溶酶體膜上的一種ATP酶型的轉(zhuǎn)運體蛋白，它通過水解ATP獲能跨膜轉(zhuǎn)運重金屬離子和多胺類物質(zhì)[92]，其功能異常會影響溶酶體pH、降解功能和自噬流，引起α-突觸核蛋白積累和神經(jīng)毒性[93]。ATP13A2的突變會導(dǎo)致早發(fā)型帕金森病和Kufor-Rakeb綜合征，這是一種伴有癡呆的帕金森樣疾病[94-95]。研究發(fā)現(xiàn)ATP13A2的突變和神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥相關(guān)，因此根據(jù)這一疾病相關(guān)蛋白的命名規(guī)則被命名為CLN12[96]。此外，在少數(shù)ALS病人中也發(fā)現(xiàn)了ATP13A2的突變，進一步說明這一轉(zhuǎn)運體蛋白與神經(jīng)退行性疾病的高度相關(guān)性及其分子機制的復(fù)雜性。

NPC1是溶酶體膜上的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運體，NPC2則是溶酶體腔內(nèi)的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，它們協(xié)同作用將脂質(zhì)從溶酶體腔內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞漿或其他細胞器，而它們的突變則會導(dǎo)致溶酶體內(nèi)膽固醇和鞘脂的積累，進而引起C型尼曼匹克病，這一疾病會引起系統(tǒng)性神經(jīng)退行性病變[97]。

3.3 結(jié)構(gòu)性蛋白LAMP和LIMP

在所有溶酶體膜蛋白中，LAMP(lysosome-associated membrane protein)是溶酶體膜上含量最多的類型，其中LAMP-1和LAMP-2兩種蛋白已占溶酶體膜蛋白總量一半左右[98]。LMAP-1和LAMP-2的功能有一定的互補性，雙重缺陷的動物有胚胎致死的表型，而單一蛋白缺陷的表型則弱得多[99]。LAMP-1缺陷的小鼠腦中僅存在輕微的星形膠質(zhì)細胞增生，并沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的腦功能異常，且溶酶體功能也未見顯著變化[100]。LAMP-2缺陷小鼠則有更明顯的表型，包括自噬囊泡的積累和心肌收縮力減弱，并且有一半左右小鼠在40 d內(nèi)死亡[101]。LAMP-2缺陷在人類中會導(dǎo)致Danon病，主要表現(xiàn)為心肌病和骨骼肌病，同時伴有神經(jīng)退行性病變引起的智力障礙和視網(wǎng)膜損傷等[102]。Danon病人的細胞中存在糖原在溶酶體中聚集和自噬囊泡聚集的現(xiàn)象。相比LAMP-1和-2，LAMP-3的表達量較少，但有多個基因組學(xué)研究提示它和帕金森病有關(guān)[103]。

另一類溶酶體膜結(jié)構(gòu)性蛋白是LIMP(lysosomal integral membrane protein)。LIMP-2蛋白與溶酶體脂質(zhì)代謝相關(guān)，它參與磷脂和膽固醇的轉(zhuǎn)運[104-105]，同時它也是β-葡糖腦苷脂酶的受體，協(xié)助將β-葡糖腦苷脂酶遞送到溶酶體內(nèi)，因此和戈謝氏病及帕金森病相關(guān)[106]。LIMP-2缺陷的小鼠表現(xiàn)出多方面的神經(jīng)系統(tǒng)異常[107]。

3.4 溶酶體運輸復(fù)合體原件

VPS35是一種定位于溶酶體/內(nèi)體膜上的蛋白，它是逆向運輸復(fù)合體的關(guān)鍵元件，這一復(fù)合體介導(dǎo)囊泡系統(tǒng)向高爾基體的逆向運輸[108]。VPS35的突變在奧地利的家族性帕金森病人中被發(fā)現(xiàn)，從而揭開了它與帕金森病的關(guān)系[109]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)VPS35的缺陷會影響溶酶體對α-突觸核蛋白的降解并導(dǎo)致線粒體碎片化，進而引起多巴胺能神經(jīng)元死亡和帕金森病的發(fā)生[110-111]。此外，也有研究提示VPS35和阿爾茨海默病相關(guān)：在AD病人的海馬中，VPS35的表達降低，而VPS35的雜合缺陷小鼠也表現(xiàn)出多種AD的表型，包括Aβ和淀粉樣斑塊積累、認知記憶障礙、LTP缺陷和突觸傳遞受損等[112]；在AD小鼠模型中，藥物干預(yù)以提高VPS35的表達水平對AD癥狀也有很好的緩解作用，進一步表明VPS35是神經(jīng)退行性疾病藥物開發(fā)的重要靶點。

3.5 溶酶體膜嵌合型酶

除了腔內(nèi)的可溶性酶外，溶酶體膜上也存在多種膜嵌合的酶。HGSNAT(乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷-N-乙?；D(zhuǎn)移酶)就是溶酶體膜嵌合型的酶，它可以催化將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到肝素-α-氨基葡萄糖苷上，是黏多糖等聚糖降解中的一種重要溶酶體酶。HGSNAT突變導(dǎo)致IIIC型黏多糖病，主要特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，癥狀包括癡呆、視力喪失、耳聾、癲癇、暴躁、失眠等[113]。

3.6 功能未知的溶酶體膜蛋白

溶酶體膜上還存在很多功能尚不清楚的蛋白，其中一些蛋白的編碼基因突變也會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，如神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥的兩個致病基因CLN3和CLN7[114-115]。CLN3的氨基酸序列和其他功能已知的蛋白并沒有明顯的相似性，而CLN7則與MFS轉(zhuǎn)運體超家族存在序列相似性，因此也被命名為MFSD8，它可能是一個轉(zhuǎn)運體蛋白，但其轉(zhuǎn)運底物尚不清楚。這兩個基因突變導(dǎo)致的NCL疾病目前還沒有很好的治療手段，因此解析它們的蛋白功能及引起疾病的機制有望為臨床治療和藥物開發(fā)指明方向。

4 溶酶體的細胞內(nèi)定位

細胞中通常都包含多個溶酶體。在不同類型的細胞中，溶酶體的數(shù)量、大小和分布存在很大差異，而且這些溶酶體在細胞內(nèi)的分布并非是一成不變的，而是處于動態(tài)變化中，且受細胞狀態(tài)和多種信號的調(diào)控[116]。溶酶體可以在馬達蛋白的驅(qū)動下沿著微管快速移動，其中驅(qū)動蛋白(Kinesin)驅(qū)動溶酶體的順行運動，即從核周區(qū)域(靠近細胞核)向外周區(qū)域(靠近細胞膜)移動，而動力蛋白(Dynein)驅(qū)動溶酶體的逆行運動，即從外周區(qū)域向核周區(qū)域移動。此外，BORC、Arl8、SKIP、Rab7、FYCO1、RILP、ORP1L等蛋白及蛋白復(fù)合物和Kinesin/Dynein一起構(gòu)成溶酶體轉(zhuǎn)運的分子機器[116-117]。溶酶體在細胞內(nèi)分布與其功能密切相關(guān)，處于不同亞細胞區(qū)域的溶酶體往往發(fā)揮不同的功能。如外周區(qū)域分布的溶酶體更多參與細胞膜修復(fù)、分泌、營養(yǎng)感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，而核周分布的則更多參與自噬[117-118]。此外，溶酶體的快速移動也有助于溶酶體與其他細胞器的互作，如內(nèi)吞體、自噬體和線粒體等。

神經(jīng)元是具有特殊形態(tài)的細胞，通常包括胞體、樹突和軸突這些形態(tài)結(jié)構(gòu)上完全不同的部分。溶酶體在神經(jīng)元不同部位的分布也存在很大差異，一般來說在胞體部分分布最為豐富，而在軸突分布則較少。由于軸突中沒有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，溶酶體成熟所需的很多物質(zhì)無法在軸突合成，傳統(tǒng)的觀點認為軸突中的溶酶體是不成熟的，無法發(fā)揮降解功能[119]。軸突以及軸突末梢存在旺盛的內(nèi)吞和自噬活動，以清除老化和損傷的蛋白和細胞器[120]。自噬體最終要與溶酶體融合以完成降解過程，因此這些軸突內(nèi)產(chǎn)生的自噬體需要通過逆向運輸送到胞體才能與成熟的溶酶體融合[120-121]。但近期也有研究發(fā)現(xiàn)胞體部位的成熟溶酶體也會被順向運輸?shù)捷S突遠端參與局部區(qū)域的降解過程[122]。相較于軸突來說，樹突中存在更多的溶酶體。溶酶體在樹突中的分布受突觸信號傳遞的調(diào)控，同時也參與了突觸可塑性的調(diào)控。如谷氨酸受體的激活會增加樹突棘部位的溶酶體數(shù)量，進而增強局部的降解能力，并參與對內(nèi)吞受體的降解[123]。此外，溶酶體的分泌也會影響樹突棘形態(tài)可塑性的調(diào)控[124]。

總之，溶酶體在神經(jīng)元中的分布和運輸對神經(jīng)元功能至關(guān)重要，異常的溶酶體定位和運輸與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。研究人員已經(jīng)在多種精神類疾病和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)溶酶體定位和運輸元件的突變，如溶酶體轉(zhuǎn)運關(guān)鍵蛋白復(fù)合物BORC的亞基BORCS7的單核苷酸多態(tài)性是導(dǎo)致精神分裂癥的一個主要危險因素[125]，而dynactin的p150亞基的突變也在部分ALS病人中被發(fā)現(xiàn)[126]。在另一種神經(jīng)退行性疾病SPOAN(spastic paraplegia, optic atrophy and neuropathy)中，kinesin的KLC2亞基的基因上游內(nèi)含子中存在大片段缺失，進而導(dǎo)致KLC2的過度表達，是導(dǎo)致發(fā)病的重要原因[127]。

除了這些溶酶體運輸原件外，多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白也會間接影響溶酶體的運輸和定位。亨廷頓病相關(guān)蛋白huntingtin是囊泡運輸?shù)囊粋€重要調(diào)控因子，它可以直接和dynein結(jié)合，促進dynein/dynactin介導(dǎo)的囊泡運輸[128]。敲低huntingtin會導(dǎo)致溶酶體更多向外周區(qū)域分布，而表達huntingtin則會促進溶酶體向核周區(qū)域聚集[129]。在亨廷頓病的細胞模型中，突變的huntingtin導(dǎo)致溶酶體向核周區(qū)域聚集，并伴隨著溶酶體功能的改變、mTORC1的激活以及自噬流的增強[130]。LRRK2(Leucine-rich repeat kinase 2，富亮氨酸重復(fù)激酶2)是帕金森病最重要的致病基因，它的突變是導(dǎo)致家族性帕金森病最常見的因素，同時也是散發(fā)型帕金森病的危險因子[131]。盡管LRRK2的功能及其致病機制尚未完全清楚，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)：LRRK2參與內(nèi)體和溶酶體的運輸及定位的調(diào)控；LRRK2蛋白可以定位到溶酶體內(nèi)體膜上，也可以與早期內(nèi)體膜蛋白Rab5及晚期內(nèi)體/溶酶體膜蛋白Rab7相結(jié)合，從而影響內(nèi)體和溶酶體的運輸；LRRK2的敲除、過表達以及致病性突變均會改變?nèi)苊阁w在細胞內(nèi)的定位[132-133]。

除了這些常見的神經(jīng)退行性疾病外，一些以神經(jīng)退行性病變?yōu)橹饕卣鞯娜苊阁w貯積癥中也存在溶酶體運輸和定位的異常，如戈謝氏病、尼曼-匹克病、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、黏脂沉積癥等。部分戈謝氏病患者存在嚴重的神經(jīng)退行性病理特征，包括神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元丟失等。在這種神經(jīng)性的戈謝氏病中，研究發(fā)現(xiàn)溶酶體的數(shù)量和細胞內(nèi)分布的異常[134]。C型尼曼匹克病(NPC)的主要臨床癥狀包括神經(jīng)系統(tǒng)的異常，如認知損傷、癲癇、共濟失調(diào)等。NPC細胞均表現(xiàn)出自噬的異常，這些細胞中的溶酶體也會更集中在核周區(qū)域，表明溶酶體分布和運輸受到了影響。同時，NPC細胞中溶酶體向軸突的運輸也受到了影響，導(dǎo)致軸突自噬受阻和軸突營養(yǎng)不良[135]。另外，神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥相關(guān)蛋白CLN3可以與溶酶體運輸動力系統(tǒng)中的多個蛋白相結(jié)合，如tubulin、dynactin、dynein、kinesin-2、Rab7、RILP等，進而調(diào)控溶酶體在細胞內(nèi)的定位和運輸[136]。而四型黏脂沉積癥相關(guān)蛋白TRPML1則可以通過釋放溶酶體內(nèi)的鈣離子，促進溶酶體向核周區(qū)域聚集[73]。

5 總結(jié)和展望

人們對溶酶體的認知從最初的“回收站”拓展到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子平衡、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和細胞命運決定等多個方面，溶酶體與多種類型疾病的關(guān)系也被逐步揭示。目前，靶向調(diào)控溶酶體的策略已逐步成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的重要方向，已有多種調(diào)控溶酶體功能的小分子化合物被開發(fā)出來，包括分子伴侶、V-ATPase抑制劑、酶活性調(diào)節(jié)劑、離子通道調(diào)節(jié)劑等，部分化合物展現(xiàn)出很好的藥物開發(fā)潛力[3]。除了小分子藥物外，新型生物技術(shù)和生物大分子藥物也在溶酶體調(diào)控方面得到了應(yīng)用，例如，酶替代療法已經(jīng)用于一些溶酶體貯積癥的臨床治療，多項針對溶酶體的基因療法的開發(fā)也已進入臨床試驗階段[50]。

隨著對溶酶體研究的逐步深入，溶酶體與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系也逐步清晰，越來越多的研究揭示了溶酶體功能異常在多種不同類型神經(jīng)退行性疾病中的作用。神經(jīng)退行性疾病的藥物開發(fā)在過去幾十年間經(jīng)歷了大量的失敗，而靶向溶酶體治療神經(jīng)退行性疾病的新思路有望為這一局面帶來改觀，大量直接或間接作用于溶酶體相關(guān)通路的藥物已被用于神經(jīng)退行性疾病的藥物開發(fā)[10]。神經(jīng)細胞不可逆的死亡是神經(jīng)退行性疾病治療中最為棘手的問題，而神經(jīng)干細胞是補充丟失的神經(jīng)元的重要策略。已有研究發(fā)現(xiàn)非特異地激活溶酶體可以使衰老的神經(jīng)干細胞恢復(fù)活性，為中晚期神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的思路[137]。

需要注意的是，由于溶酶體分布的廣泛性和功能的多樣性，干預(yù)溶酶體可能對細胞和機體產(chǎn)生多方面的影響，因此靶向溶酶體的藥物也可能產(chǎn)生各種副作用。溶酶體還有很強的異質(zhì)性，同一細胞中不同的溶酶體分別參與不同的功能[138]，可能僅僅是部分溶酶體參與了疾病的發(fā)生發(fā)展中，如何特異性干預(yù)特定的溶酶體群體還有待進一步研究。此外，溶酶體位于細胞內(nèi)，部分溶酶體靶點更是位于溶酶體腔內(nèi)，如何將藥物準(zhǔn)確遞送到靶點所在的位置也是需要解決的問題。

總之，進一步加強對溶酶體和神經(jīng)退行性疾病的研究，闡明溶酶體功能異常導(dǎo)致疾病發(fā)生的詳細機制，鑒定新的溶酶體靶點，設(shè)計更有針對性和特異性的藥物及干預(yù)策略，有望為神經(jīng)退行性疾病的藥物開發(fā)帶來新的突破。