成人哮喘患者Treg/Th17細(xì)胞失衡與呼出氣一氧化氮的相關(guān)性研究①

覃松梅 劉彤 龍勝澤 藍(lán)嬌 韋彩周 農(nóng)向陽(yáng) 冉果 覃雪軍

（廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021）

支氣管哮喘是由肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，其發(fā)病率在逐年上升，成為最常見(jiàn)的慢性疾病之一［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有4.3%人口罹患哮喘，我國(guó)最新流行病學(xué)調(diào)查資料顯示哮喘的總患病率為4.2%，即我國(guó)可能有4 570萬(wàn)哮喘患者。哮喘的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，可能與感染、環(huán)境因素、過(guò)敏體質(zhì)和多基因遺傳等相關(guān)［2］。近年來(lái)，哮喘患者體內(nèi)Treg與Th17細(xì)胞失衡逐漸被認(rèn)識(shí)并日益受到關(guān)注?？刂茪獾姥装Y和緩解哮喘癥狀是治療哮喘的最終目標(biāo)。FeNO是由氣道細(xì)胞產(chǎn)生，可作為一種非創(chuàng)傷性并可直接量化氣道炎癥的生物標(biāo)志物，已成為氣道炎癥研究的新熱點(diǎn)。故本研究檢測(cè)了哮喘與慢性咳嗽非哮喘患者FeNO值及外周血Treg/Th17細(xì)胞，旨在分析哮喘患者FeNO水平與Treg/Th17失衡的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料回顧分析廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院自2017年12月至2018年6月呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的慢性咳嗽患者33例，其中17例為哮喘慢性持續(xù)期及咳嗽變異性哮喘患者，16例為非哮喘及非咳嗽變異性哮喘的慢性咳嗽患者。哮喘診斷、分級(jí)分期及咳嗽變異性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年版《支氣管哮喘防治指南》［3］。（1）典型哮喘的臨床癥狀和體征：①反復(fù)發(fā)作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間及晨間多發(fā)，常與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激以及上呼吸道感染、運(yùn)動(dòng)等有關(guān)；②發(fā)作時(shí)雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長(zhǎng)；③上述癥狀和體征可經(jīng)治療緩解或自行緩解。（2）可變氣流受限的客觀檢查：①支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽(yáng)性（吸入支氣管舒張劑后，F(xiàn)EV1增加>12%，且FEV1絕對(duì)值增加>200 ml）；②支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性；③呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）平均每日晝夜變異率>10%，或PEF周變異率>20%。符合典型哮喘的臨床癥狀和體征，同時(shí)具備氣流受限客觀檢查中的任一條，并排除其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽，可以診斷為哮喘。哮喘慢性持續(xù)期是指每周均不同頻度和（或）不同程度地出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。非哮喘的慢性咳嗽按2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》［4］診斷標(biāo)準(zhǔn)排除表現(xiàn)為慢性咳嗽的支氣管哮喘及咳嗽變異性哮喘患者。咳嗽變異性哮喘：咳嗽作為唯一或主要癥狀，無(wú)喘息、氣急等典型哮喘的癥狀和體征，同時(shí)具備可變氣流受限客觀檢查中的任一條，排除其他疾病所引起的咳嗽。慢性咳嗽診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年版《咳嗽的診斷與治療指南》［4］：咳嗽持續(xù)時(shí)間超過(guò)8周，肺部影像學(xué)未見(jiàn)異常。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有研究對(duì)象年齡≥15周歲；②無(wú)精神障礙；③無(wú)肺炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①來(lái)院時(shí)處于哮喘急性發(fā)作期及緩解期的患者，由于哮喘急性發(fā)作會(huì)誘發(fā)許多相關(guān)免疫反應(yīng)，而緩解期患者免疫狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，故予排除；②合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾??；③近期（1個(gè)月內(nèi)）采用過(guò)全身激素治療；④妊娠或哺乳期。本研究得到了廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器及試劑流式細(xì)胞儀（BD FACS CantoⅡ，美國(guó)）；流式抗體、淋巴細(xì)胞刺激劑（BD公司，美國(guó)）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（CellMax，新西蘭）；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液（Thermo，美國(guó)）；IL-17 ELISA試劑盒（Abcam公司，英國(guó)）；酶標(biāo)儀（山東高密彩虹分析GF-M3000，中國(guó)）；納庫(kù)侖呼氣分析儀（Sunvou，中國(guó)）；MasterScreen肺功能儀（耶格公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 肺功能測(cè)定用力肺活量（FVC）和第1秒用力呼氣容積（FEV1）：由同一位經(jīng)肺功能檢測(cè)培訓(xùn)的醫(yī)師完成。

1.2.2 呼出氣一氧化氮測(cè)定FeNO值測(cè)定由同一位接受過(guò)培訓(xùn)的技師通過(guò)納庫(kù)侖呼氣分析儀完成。檢測(cè)前1 d禁熏制品及腌制品等食物，檢測(cè)前1 h禁止進(jìn)食、吸煙、劇烈運(yùn)動(dòng)等。使用鼻夾夾緊患者鼻部，讓患者吸氣到最大肺活量通過(guò)濾嘴緩慢向測(cè)試儀器呼氣，保持呼氣速率（50±5）ml/s，儀器自動(dòng)分析得出FeNO值。

1.2.3 外周血Treg和Th17細(xì)胞的檢測(cè)真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml，分別在2個(gè)流式檢測(cè)管內(nèi)取500 μl全血，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝罅呀?~10 min，融入1640培養(yǎng)基至8 ml，2 000 r/min離心5 min，棄上清；加入適量1640重懸，加入細(xì)胞刺激劑置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育6 h。第一管加入熒光標(biāo)記單抗CD4-FITC 20μl，第二管加入抗體CD4-FITC、CD25-APC各20 μl，常溫避光孵育25 min。兩管分別先后加入細(xì)胞固定/破膜緩沖液1.5 ml、染色緩沖液1 ml，常溫避光孵育20~30 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清。于第一管內(nèi)加入胞內(nèi)熒光標(biāo)記單抗IL-17A-PerCP-Cy5.5 5 μl，第二管加入抗體FoxP3-PE 20 μl，常溫避光孵育30 min。加入1 ml染色緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入2%多聚甲醛200μl重懸細(xì)胞并固定，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)外周血血漿IL-17水平真空肝素鈉抗凝管采集患者外周靜脈血2 ml，4℃、2 000 r/min離心5 min，收集上清-80℃保存，IL-17水平檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每份標(biāo)本測(cè)定2次，結(jié)果取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組間數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行處理，變量呈正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson分析或Spearman秩相關(guān)分析，數(shù)據(jù)用±s表示。P<0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基礎(chǔ)資料對(duì)比共納入患者33例，哮喘組17例，其中咳嗽變異性哮喘7例、輕度慢性持續(xù)期哮喘4例、中度慢性持續(xù)期哮喘6例；非哮喘慢性咳嗽組16例，其中變應(yīng)性咳嗽10例、胃食管反流性咳嗽6例。各組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 各組基礎(chǔ)資料對(duì)比Tab.1 Comparison of basic data of each group

2.2 Treg、Th17細(xì)胞、Treg/Th17、IL-17、FeNO表達(dá)情況兩組外周血Treg占CD4+T淋巴細(xì)胞比例無(wú)明顯差異［（0.80±0.39）%vs（1.04±0.25）%，P=0.091］；哮喘組患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組［（4.01±2.11）%vs（0.93±0.75）%，P<0.001］；哮喘組Treg/Th17細(xì)胞的比值明顯低于非哮喘的慢性咳嗽組［（0.24±0.19）% vs（2.55±2.59）%，P<0.001］；哮喘組外周血血漿IL-17濃度明顯高于非哮喘的慢性咳嗽組［（4.60±1.96）ng/L vs（3.01±1.97）ng/L，P=0.012］；哮喘組FeNO水平高于非哮喘的慢性咳嗽組［（95.53±37.86）ppb vs（26.94±9.84）ppb，P<0.001］。見(jiàn)表2和圖1、2。

圖1 外周血Treg、Th17細(xì)胞流式圖Fig.1 Flow cytometry of Treg，Th17 cells in peripheral blood

表2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例比較（±s）Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups（±s）

表2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例比較（±s）Tab.2 Comparisons of proportions of Treg and Th17 cells in CD4+T lymphocytes in peripheral blood between two groups（±s）

Groups Asthma group Chronic cough group t Z P Number of cases（n）17 16 Treg/%0.80±0.39 1.04±0.25-1.766-0.091 Th17/%4.01±2.11 0.93±0.75--3.942<0.001 Treg/Th17 0.24±0.19 2.55±2.59--3.809<0.001

2.3 Treg、Th17、Treg/Th17和FeNO之 間 的 相 關(guān)性哮喘組FeNO值與外周血Treg占比無(wú)相關(guān)性（r=-0.328，P=0.253），與Th17細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.663，P=0.01），與Treg/Th17細(xì)胞比值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.757，P=0.002），見(jiàn)圖3。

圖2 兩組外周血Treg、Th17細(xì)胞、Treg/Th17、血漿IL-17濃度、FeNO水平對(duì)比Fig.2 Comparisons of Treg，Th17 cells，Treg/Th17 in peripheral blood，IL-17 concentration in plasma and level of FeNO between two groups

圖3 FeNO水 平 與Treg、Th17細(xì) 胞、Treg/Th17細(xì) 胞 的相關(guān)性Fig.3 Correlations between FeNO and Treg，Th17 cells，Treg/Th17

3 討論

哮喘是呼吸科常見(jiàn)的氣道慢性炎癥疾病。近年來(lái)隨生活習(xí)慣及環(huán)境的改變，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。數(shù)據(jù)顯示全世界哮喘患者大約有1.5~2億例，而治療哮喘的過(guò)程漫長(zhǎng)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［5］。研究表明哮喘患者氣道的慢性炎癥主要是由輔助性T（Th）淋巴細(xì)胞介導(dǎo)所致，其中Th1/Th2細(xì)胞及其特征細(xì)胞因子譜的失衡被認(rèn)為與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，Th1/Th2失衡參與疾病的發(fā)病過(guò)程，但逆轉(zhuǎn)Th1/Th2失衡卻不能使哮喘患者的癥狀得到完全緩解［6-8］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在哮喘患者體內(nèi)還存在Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞失衡［9］。

Th17細(xì)胞是一種能夠分泌IL-17的T細(xì)胞亞群，在自身免疫病、感染等疾病中發(fā)揮重要作用［10］。Th17細(xì)胞的分化由RORγt和RORα共同介導(dǎo)，IL-23并不參與初始T淋巴細(xì)胞的分化，但其也是維持Th17細(xì)胞增殖和功能穩(wěn)定的重要因子。Treg是免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞，在多種疾病中參與調(diào)節(jié)變態(tài)反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)等，避免機(jī)體出現(xiàn)免疫失衡［11-12］。JIANG等［13］研究表明，在被卵清蛋白致敏的小鼠哮喘模型中，小鼠肺組織里Treg/Th17細(xì)胞比例降低，表明小鼠哮喘的發(fā)病與Treg/Th17細(xì)胞失衡存在一定聯(lián)系。本研究分析哮喘患者與非哮喘慢性咳嗽患者Treg、Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)與非哮喘慢性咳嗽組相比，哮喘組Th17細(xì)胞呈高表達(dá)，且IL-17的表達(dá)也呈高表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明，Th17細(xì)胞及IL-17的表達(dá)水平上升與哮喘發(fā)病密切相關(guān)。其原因是哮喘患者在接觸過(guò)敏原刺激后，Th17細(xì)胞生成IL-17，促進(jìn)氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)性炎癥反應(yīng)，最終促使患者哮喘發(fā)作［14］。

T淋巴細(xì)胞在哮喘發(fā)生過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用，T細(xì)胞參與氣道炎癥的免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在正常情況下，T淋巴細(xì)胞及亞群數(shù)目處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，當(dāng)T淋巴細(xì)胞呈高表達(dá)則哮喘患者氣道炎癥發(fā)生變化。相關(guān)研究證實(shí)，哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制還包括Treg數(shù)目的變化［15］。當(dāng)哮喘患者接觸到過(guò)敏原后，體內(nèi)Treg數(shù)目明顯發(fā)生變化，但各研究團(tuán)隊(duì)對(duì)Treg變化趨勢(shì)的研究結(jié)果不一致。XIN等［16］研究顯示，Treg在輕度和中度哮喘患者中數(shù)目呈增多趨勢(shì)，且會(huì)根據(jù)病情的加重而增多。STELMASZCZYK-EMMEL等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Treg在兒童過(guò)敏性哮喘患者中呈減少趨勢(shì)，但在不同病情與年齡段Treg表達(dá)水平不同。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組患者Treg/Th17下降，提示哮喘患者存在Treg/Th17細(xì)胞失衡現(xiàn)象，Th17細(xì)胞數(shù)量增多是引起Treg/Th17細(xì)胞失衡的主要因素。

FeNO是當(dāng)氣道受到炎癥或炎癥因子刺激時(shí)所合成產(chǎn)生的，在哮喘患者中FeNO值明顯升高，F(xiàn)eNO值可在一定程度上反映氣道炎癥水平［18-19］。氣道炎癥的深層原因與Treg/Th17細(xì)胞的失衡相關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Treg/Th17細(xì)胞失衡與FeNO相關(guān)性尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者FeNO值與外周血中Treg/Th17細(xì)胞比值呈負(fù)相關(guān)，表明FeNO值在一定程度上反映哮喘患者體內(nèi)Treg/Th17細(xì)胞失衡。當(dāng)哮喘患者接觸過(guò)敏原后，受到刺激的Th17細(xì)胞活化生成IL-17，兩者共同誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞釋放趨化因子，從而使氣道炎癥持續(xù)，F(xiàn)eNO作為炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物隨之升高。Th17細(xì)胞在哮喘患者呈高表達(dá)，同時(shí)FeNO值也呈高表達(dá)，兩者呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明FeNO值及Th17細(xì)胞水平升高與哮喘發(fā)病相關(guān)，可作為哮喘氣道炎癥發(fā)病機(jī)制中的重要指標(biāo)之一。

綜上所述，F(xiàn)eNO水平的升高與Treg/Th17細(xì)胞失衡密切相關(guān)，尤其與Th17細(xì)胞增加的關(guān)系更加密切，患者Th17細(xì)胞升高導(dǎo)致氣道炎癥發(fā)生，進(jìn)一步導(dǎo)致FeNO值上升，為哮喘的診治提供新的依據(jù)，F(xiàn)eNO水平可作為診斷哮喘或預(yù)測(cè)哮喘發(fā)作的指標(biāo)，而Th17細(xì)胞增高導(dǎo)致FeNO值隨之升高的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。