胰腺癌B7-H4與相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值研究①

嚴(yán)小甜 錢韻

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310009）

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的不斷發(fā)展，血清腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的篩查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)療效和隨診等方面顯示出越來越重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

胰腺癌作為一種侵襲性較高的惡性腫瘤，由于缺乏有效的早期診斷方法，導(dǎo)致大多患者確診時(shí)已處于中晚期，手術(shù)切除預(yù)后差。CA199是胰腺癌目前為止最具敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)志物，并已顯示出其在臨床輔助診斷中的作用，可普遍用于早期診斷、預(yù)后評(píng)估以及術(shù)后監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但單一標(biāo)志物的應(yīng)用仍具有局限性［1-4］。因此，亟需尋求新的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胰腺癌進(jìn)行早期診斷及預(yù)后評(píng)估。

以往的研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中B7-H4表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于非腫瘤患者胰腺組織，且胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。同時(shí)，胰腺癌組織中B7-H4的表達(dá)水平與TNM分級(jí)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及分化顯著相關(guān)，此外，B7-H4表達(dá)水平可作為獨(dú)立的胰腺癌預(yù)后指標(biāo)［5-6］。

因此，本研究旨在評(píng)估原發(fā)胰腺癌患者的腫瘤組織中B7-H4表達(dá)水平與術(shù)前血清CEA、CA199及CA242表達(dá)水平的相關(guān)性，探究各標(biāo)志物在胰腺癌預(yù)后中的價(jià)值，以期方便快捷地對(duì)非手術(shù)患者以及術(shù)后患者進(jìn)行有效的評(píng)估和監(jiān)測(cè)。

1 資料與方法

1.1 資料本實(shí)驗(yàn)共納入2011年1月至2014年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院確診為胰腺癌的188例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在2011年1月至2014年12月期間首次診斷為胰腺癌患者；②首次因胰腺癌行根治術(shù)或姑息術(shù)、且術(shù)后病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌患者；③經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌；④術(shù)前尚未進(jìn)行輔助放化療或免疫治療；⑤患者近期未發(fā)生感染及自身免疫性疾?。虎扌g(shù)前進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查。獲得的臨床數(shù)據(jù)包括患者信息、腫瘤分化、腫瘤分級(jí)和治療方法。所有組織樣本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋后制成組織切片，并由兩名病理醫(yī)生通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片明確診斷。本研究遵守浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色使用EnVisionTM兩步法（Dako，斯特魯普，丹麥）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將石蠟包埋組織進(jìn)行5μm連續(xù)切片并轉(zhuǎn)移到干燥免疫組化專用玻片，進(jìn)行脫蠟、水化、封閉、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次、羊血清封閉減少非特異性結(jié)合，最后將組織與兔抗B7-H4單克隆抗體4℃孵育過夜，隨后滴加相應(yīng)二抗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，中性樹脂封片。

1.2.2 組織B7-H4染色評(píng)分請(qǐng)兩位沒有接觸到患者臨床信息的病理醫(yī)生隨機(jī)選出5個(gè)400倍鏡下放大切片視野，進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，染色結(jié)果表明B7-H4高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。以半定量方法［6］評(píng)估B7-H4的表達(dá)，其陽(yáng)性細(xì)胞的比例計(jì)分如下：0分（≤5%）；1分（6%~25%）；2分（26%~50%）；3分（51%~75%）；4分（>75%）。染色強(qiáng)度評(píng)估如下：0分（無染色）；1分（弱染色，淡黃色）；2分（溫和的染色，黃棕色）；3分（強(qiáng)染色，深棕色）。染色積分=陽(yáng)性比例×染色強(qiáng)度：0分（陰性）；1~4分（弱陽(yáng)性）；5~8分（中度陽(yáng)性）；9~12分（強(qiáng)陽(yáng)性）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定染色積分<9時(shí)，B7-H4為低表達(dá)；≥9時(shí)，B7-H4為高表達(dá)。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志物水平檢測(cè)收集188例胰腺患者手術(shù)前1周內(nèi)靜脈血清標(biāo)本，每份血清1 ml。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中CEA及CA199含量，采用流式熒光發(fā)光法檢測(cè)血清中CA242含量，檢測(cè)方法按試劑盒及儀器說明書進(jìn)行。判斷標(biāo)準(zhǔn)：CEA≥5 ng/ml為 陽(yáng) 性，CA199≥37 U/ml為 陽(yáng) 性，CA242≥20 U/ml為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，由單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析B7-H4的表達(dá)和臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。總生存期（overall survival，OS）的計(jì)算為胰腺癌的初診到患者死亡。采用Kaplan-Meier分析和Tarone-Ware檢驗(yàn)分析患者生存期差異。相關(guān)性比較采用Pearson或Spearman檢驗(yàn)。受試者工作特征（ROC）曲線分析B7-H4以及術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物以及兩者聯(lián)合對(duì)胰腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的價(jià)值，曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEA、CA199及CA242表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系188例胰腺癌患者血清標(biāo)本中，67例CEA陽(yáng)性（≥5 ng/ml），121例CEA陰性（<5 ng/ml）；154例CA199陽(yáng)性（≥37 U/ml），34例CA199陰性（<37 U/ml）；109例CA242陽(yáng) 性（≥20 U/ml），79例CA242陰性（<20 U/ml）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清CEA水平與胰腺癌患者的TNM分期及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者血清CEA水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期（P<0.05），有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清CEA水平顯著高于沒有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者水平（P<0.05）。血清CEA水平與胰腺癌患者的年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05）。血清CA199及CA242水平均與胰腺癌患者的年齡及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān)，≥65歲的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平顯著高于<65歲患者（P<0.05），有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平顯著高于沒有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者水平（P<0.05）。血清CA199及CA242水平與胰腺癌患者的性別、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05，表1）。

表1 胰腺癌患者腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression level of tumor markers and clinical characteristics in patients with pancreatic cancer

2.2 CEA、CA199及CA242表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系隨訪至2016年12月，本次回顧性分析的188例胰腺癌患者均已死亡。從Kaplan-Meier生存曲線看，CA199表達(dá)陰性組的生存曲線高于CA199陽(yáng)性組，經(jīng)Tarone-Ware檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.046，圖1）。CA199陽(yáng)性患者OS為（9.10±0.66）個(gè)月（95%CI：7.81~10.39），CA199陰性患者OS為（12.70±2.77）個(gè) 月（95%CI：7.27~18.13）。CEA陽(yáng)性患者OS為（10.00±1.29）個(gè)月（95%CI：7.48~12.52），CEA陰性患者OS為（9.90±0.70）個(gè)月（95%CI：8.54~11.27），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CA242陽(yáng)性患者OS為（9.10±0.48）個(gè)月（95%CI：8.17~10.03），CA242陰性患者OS為（10.80±1.24）個(gè)月（95%CI：8.36~13.24），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平與患者OS的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression level of tumor markers and patient OS

圖1 Kaplan-Meier生存曲線比較血清CA199水平與OS的關(guān)系Fig.1 Using Kaplan-Meier survival curve to compare relationship between serum CA199 level and OS

2.3 B7-H4與CEA、CA199及CA242表達(dá)水平之間的相關(guān)性經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，胰腺癌患者腫瘤組織B7-H4表達(dá)水平（積分水平：5.10±2.98）與手術(shù)前血清CEA表達(dá)水平（23.46±161.00）呈顯著正相關(guān)（P<0.01），而 與 血 清CA199（1 974.70±3 651.36）及CA242（86.72±132.76）表達(dá)水平之間無顯著相關(guān)性（P>0.05）。經(jīng)Spearman檢驗(yàn)，胰腺癌患者腫瘤組織B7-H4表達(dá)陽(yáng)性率與手術(shù)前血清CEA表達(dá)陽(yáng)性率顯著相關(guān)（P<0.01），而與CA199及CA242表達(dá)陽(yáng)性率無相關(guān)性（P>0.05，表3）。

表3 B7-H4與血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的Spearman相關(guān)性Tab.3 Spearman correlation between B7-H4 and serum tumor marker expression levels

2.4 B7-H4及血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值胰腺癌患者B7-H4染色積分及術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物濃度預(yù)測(cè)術(shù)后6個(gè)月生存期的ROC曲線見圖2，AUC見表4，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表5。經(jīng)Z檢驗(yàn)，B7-H4染色積分的AUC（95%CI）為0.705（0.629~0.773），明顯高于CEA的0.508（0.429~0.586）和CA242的0.518（0.439~0.596），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.726，Z=2.524；P<0.05）；而略高于CA199的0.577（0.498~0.653），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.812，P>0.05）。

由上述ROC曲線分析明確，B7-H4染色積分和CA199具有預(yù)測(cè)胰腺癌患者術(shù)后6個(gè)月生存期的價(jià)值。因此，同時(shí)分析了胰腺癌患者B7-H4染色積分聯(lián)合術(shù)前血清CA199預(yù)測(cè)術(shù)后6個(gè)月生存期的ROC曲線見圖2，AUC見表4，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見表5。經(jīng)Z檢驗(yàn)，B7-H4染色積分聯(lián)合術(shù)前血清CA199的AUC（95%CI）為0.717（0.646~0.782），明顯高于CA199，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.275，P<0.05）；而比B7-H4染色積分略高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.614，P>0.05）。

圖2 B7-H4及血清腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的ROC曲線Fig.2 ROC curve of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表4 B7-H4與血清腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的AUC面積對(duì)比Tab.4 Comparison of AUC area between B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表5 B7-H4與血清腫瘤標(biāo)志物預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的差異比較（P value，Z value）Tab.5 Comparison of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer（P value，Z value）

3 討論

胰腺癌作為消化道惡性度最高的腫瘤之一，具有高侵襲性、隱匿性及易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)［7］。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物用于評(píng)估胰腺癌切除患者預(yù)后顯得尤為重要。

血清CEA、CA199和CA242是檢測(cè)胰腺癌常用的血清標(biāo)志物［4，8］。CEA屬于免疫球蛋白超家族成員，是消化道腫瘤最常用的腫瘤標(biāo)志物之一［9］。CEA被廣泛用于輔助腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估，特別是用于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)，相比于血清CEA正常的患者，血清CEA異常患者的預(yù)后更差［10］。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者術(shù)前血清CEA水平與胰腺癌TNM分期及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)。遺憾的是，本研究中并未發(fā)現(xiàn)術(shù)前CEA水平與胰腺癌患者術(shù)后生存期相關(guān)，這可能與CEA在胰腺癌診斷與預(yù)后評(píng)估中，其敏感性和特異性都較低有關(guān)，因此往往和其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷［10］。

CA199是一種黏蛋白型糖類腫瘤標(biāo)志物，不僅可用于胰腺癌的輔助診斷，也可用于胰腺癌預(yù)后判斷［11-12］。術(shù)后CA199正?；蛐g(shù)前輕度升高（<100 U/ml）提示預(yù)后良好，而CA199血清水平術(shù)前>100 U/ml或術(shù)后>37 U/ml則與不良預(yù)后有關(guān)［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者術(shù)前血清CA199水平與胰腺癌患者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及術(shù)后生存期有關(guān)，表明血清CA199可能具有預(yù)測(cè)胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的作用及預(yù)測(cè)胰腺癌患者術(shù)后6個(gè)月生存期的價(jià)值。

CA242是一種唾液酸化鞘脂類抗原，存在于胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中，且其表達(dá)水平不受膽管良性疾病、急性胰腺炎等病變影響，在胰腺癌的鑒別診斷中有著較佳的特異性［15-16］。胰腺癌患者血清CA242水平與病程進(jìn)展有一定的平行相關(guān)性，CA242水平的升高被認(rèn)為與腫瘤的肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［17］。本組資料顯示，胰腺癌患者術(shù)前血清CA242在預(yù)測(cè)肺癌轉(zhuǎn)移中具有一定價(jià)值，但無法預(yù)測(cè)患者術(shù)后生存期。

研究表明，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與許多免疫分子相關(guān)［17］。B7-H4是調(diào)控免疫細(xì)胞應(yīng)答重要的負(fù)性共刺激分子，與腫瘤逃避免疫監(jiān)視以及腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［18-19］。之前的研究發(fā)現(xiàn)B7-H4在中晚期胰腺癌中表達(dá)增高，在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組表達(dá)高于遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移陰性組，提示與腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。這一結(jié)果說明，B7-H4可能在胰腺癌的生物學(xué)演進(jìn)上扮演了重要角色，有作為胰腺癌惡性生物學(xué)行為標(biāo)記的潛在價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)后方面，血清CA199和組織B7-H4可能具有重要的臨床價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)還分析了胰腺癌組織B7-H4與術(shù)前血清CEA、CA199和CA242之間的關(guān)系。結(jié)果表明，組織中B7-H4作為評(píng)估胰腺癌患者術(shù)后生存期的價(jià)值優(yōu)于CEA和CA242，B7-H4與CA199聯(lián)合預(yù)后的價(jià)值優(yōu)于單獨(dú)CA199?？傊?，B7-H4與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在胰腺癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估中具有重大的臨床意義，且檢測(cè)方便，減輕患者負(fù)擔(dān)，具有進(jìn)一步推廣其臨床應(yīng)用的價(jià)值［20］。

總之，本研究表明聯(lián)合檢測(cè)B7-H4/CA199對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后具有潛在的指導(dǎo)意義。本研究也存在一定的局限性：首先，本研究為單中心回顧性研究，有待未來開展前瞻性研究加以證實(shí)；其次，本研究入組患者為術(shù)前檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物水平的患者，將未檢測(cè)術(shù)前血清標(biāo)志物水平的患者排除在外，可能產(chǎn)生選擇偏倚，從而影響研究結(jié)果。