羅哌卡因抑制M1型巨噬細胞極化緩解大鼠腦缺血再灌注損傷引起的免疫紊亂和組織氧化應(yīng)激損傷①

肖旭 李光才 國小青 況小軍

（貴州航天醫(yī)院麻醉科，遵義 563000）

中風(fēng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病最嚴(yán)重的原因之一，缺血性中風(fēng)占中風(fēng)的大多數(shù)，并伴隨高病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率［1］?；謴?fù)腦血流量對于缺血性中風(fēng)后的恢復(fù)至關(guān)重要。然而恢復(fù)血流會導(dǎo)致一系列病理生理級聯(lián)反應(yīng)，從而可能進一步損傷大腦，這一過程稱為缺血再灌注損傷［2］。腦缺血再灌注損傷還與嚴(yán)重的殘疾相關(guān)，加重了個人、家庭和社會的醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)［3］。迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)理想的腦缺血再灌注損傷治療藥物。因此，尋找有效的腦缺血再灌注損傷的防治藥物是中風(fēng)研究的緊迫問題。

相關(guān)研究表明，適宜的麻醉方式有助于降低患者氧化應(yīng)激程度，減少細胞因子水平變化，改善腦組織缺血的再灌注損傷，從而促進患者恢復(fù)［4］。羅哌卡因（ropivacaine，ROP）是一種單一對映結(jié)構(gòu)體長效酰胺類局麻藥，通過抑制神經(jīng)細胞鈉離子通道，阻斷神經(jīng)的興奮與傳導(dǎo)［5］。ROP毒性較低，具有較高的安全性。目前尚無關(guān)于ROP對腦缺血再灌注損傷具體作用機制的研究報道。本文旨在探究ROP對大鼠腦缺血再灌注損傷引起的免疫紊亂和組織氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60只雄性SD級大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，8周齡，體質(zhì)量（185±10）g，許可證號：SCXK（川）2015-030。自然光照，常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 試驗藥物與主要試劑羅哌卡因（S68348）購自上海源葉生物科技有限公司，化學(xué)式：C17H26N2O，分子量：274.4，純度≥98%；蘇木素-伊紅染液（D006-1-1）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）測定試劑盒（A005-1-2）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（A003-1-2）均購自南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA測試盒（JK-a-0023）、IL-10 ELISA試劑盒（JK-a-5026）購自上海晶抗生物工程有限公司；Anti Arginase-1（ab60176）、iNOS（ab15323）、Caspase-3（ab13847）、cleaved Caspase-3（ab2302）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、c-Myc（ab39688）、β-actin（ab8227）購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組按隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組：Control組、模型組（CI/R）、CI/R+ROP 0.5 mg/kg組、CI/R+ROP 1 mg/kg組 和CI/R+ROP 2 mg/kg組。CI/R+ROP 0.5 mg/kg組、CI/R+ROP 1 mg/kg組和CI/R+ROP 2 mg/kg組分別灌胃給予羅哌卡因0.5、1、2 mg/kg［6］，Control組和CI/R組灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d，于第7天灌胃1 h后參照LONGA等［7］方法建立腦缺血再灌注大鼠模型：將所有大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰臥固定至操作臺，大鼠頸部正中切口，分離左側(cè)股靜脈、左右兩側(cè)頸總動脈、椎動脈和右側(cè)頸外動脈，除Control組外其余各組結(jié)扎并于頸總動脈分叉處開小口，將尼龍線沿頸總動脈插入頸內(nèi)動脈直至有輕微阻力為止，缺血2 h后縫合切口。

1.2.2 HE染色取各組大鼠腦組織，先用10%甲醛固定48 h，然后石蠟包埋制作切片，厚切片5 μm后，蘇木精、伊紅染色。在400倍顯微鏡下觀察腦組織損傷情況。

1.2.3 跳臺實驗將各組大鼠于實驗前1 d置于反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，實驗時將大鼠放在平臺上并接通銅柵電源，記錄各組大鼠3 min內(nèi)錯誤次數(shù)（遭電擊次數(shù)）；第2天直接將大鼠置于接通銅柵電源的平臺上，記錄3 min內(nèi)錯誤次數(shù)。

1.2.4 Y迷宮實驗Y迷宮具有3個臂，分為起始臂、新異臂和其他臂，將新異臂用隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓(xùn)練結(jié)束后，大鼠被放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后4 h抽開新異臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只大鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)。統(tǒng)計并分析大鼠新異臂進入次數(shù)。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測外周血清中巨噬細胞M1/M2極化取各組大鼠外周血0.5 ml于流式上樣管，按抗體說明書和抗體組合方案，每管分別加5μl抗體，避光孵育20 min；400 g離心5 min，棄上清PBS清洗1次，54.8 g離心5 min，收集沉淀加500μl PBS重懸，300目篩過濾，30 min內(nèi)上機檢測，Cell Quest軟件進行細胞分類分析。

1.2.6 ELISA在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔添加至96孔酶標(biāo)板，將抗原包被過夜，棄去包被液，PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標(biāo)儀測定。

1.2.7 氧化應(yīng)激按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定總SOD含量，采用可見分光光度計測定MDA、GSH含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

1.2.8 Western blot將各組大鼠腦組織于冰上或4℃解凍，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品（20 mg），100℃變性5 min，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1~2 h后加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，次日清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。β-actin作為上樣量參照，至少重復(fù)3個獨立的實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以±s表示，兩兩比較用獨立的t檢驗，組間差異采用單因素方差分析檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROP改善腦缺血再灌注損傷大鼠病理損傷和學(xué)習(xí)能力HE染色檢測各組大鼠腦組織病理損傷結(jié)果如圖1A所示，Control組皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)整，細胞核圓。CI/R組神經(jīng)元細胞排列紊亂、細胞變形、細胞質(zhì)體積小，細胞核深染，表現(xiàn)為明顯腦缺血再灌注病理損傷。CI/R+ROP 1、2 mg/kg組病理損傷程度較CI/R組明顯改善，神經(jīng)元排列較整齊，細胞核固縮深染。跳臺實驗檢測各組大鼠犯錯次數(shù)結(jié)果如圖1B，與Control組相比，CI/R組大鼠跳臺實驗中犯錯次數(shù)增加（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組大鼠跳臺實驗中犯錯次數(shù)減少（P<0.05）；通過Y迷宮實驗檢測各組大鼠新異臂進入次數(shù)結(jié)果如圖1C，與Control組相比，CI/R組大鼠新異臂進入次數(shù)減少（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組大鼠新異臂進入次數(shù)增加（P<0.05）。

圖1 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠病理損傷程度和學(xué)習(xí)能力的影響（×200）Fig.1 Effects of ROP on degree of pathological injury and learning ability of rats with cerebral ischemiareperfusion injury（×200）

2.2 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1含量，升高M2含量通過流式分選檢測各組大鼠外周 血 中 巨 噬細胞M1（F4/80+iNOS+）、M2（F4/80+Arg-1+）含量結(jié)果如圖2所示，與Control組相比，CI/R組M1含量升高，M2含量降低（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組M1含量降低，M2含量升高（P<0.05）。

圖2 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1、M2含量的影響Fig.2 Effect of ROP on contents of M1 and M2 in peripheral blood of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.3 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6含量，升高IL-10含量ELISA檢測各組大鼠IL-6、IL-10含量結(jié)果如圖3所示，與Control組相比，CI/R組IL-6含量升高，IL-10含量降低（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組IL-6含量降低，IL-10含量升高（P<0.05）。

圖3 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6、IL-10含量的影響Fig.3 Effect of ROP on IL-6 and IL-10 levels in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.4 ROP上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠Arg-1蛋白表達水平，下調(diào)iNOS蛋白表達水平Western blot檢測各組大鼠腦組織中Arg-1、iNOS蛋白表達水平結(jié)果如圖4所示，與Control組相比，CI/R組Arg-1蛋白水平降低，iNOS蛋白水平升高（P<0.05）。與CI/R組相比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組Arg-1蛋白水平升高，iNOS蛋白水平降低（P<0.05）。

圖4 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠Arg-1、iNOS蛋白表達水平的影響Fig.4 Effects of ROP on expression levels of Arg-1 and iNOS in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.5 ROP升高腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量試劑盒檢測各組大鼠SOD、GSH、MDA含量結(jié)果如圖5所示，與Control組相比，CI/R組SOD、GSH含量降低，MDA含量升高（P<0.05）。與CI/R組 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組SOD、GSH含量升高，MDA含量降低（P<0.05）。

圖5 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH、MDA含量的影響Fig.5 Effects of ROP on SOD，GSH and MDA contents in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

2.6 ROP降低腦缺血再灌注損傷大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上調(diào)c-Myc蛋白表達水 平Western blot檢 測 各 組 大 鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表達水平結(jié)果如圖6所示，與Control組相比，CI/R組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3升高，c-Myc蛋白水平降低（P<0.05）。與CI/R組 相 比，CI/R+ROP 1、2 mg/kg組Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3降低，c-Myc蛋白水平升高（P<0.05）。

圖6 ROP對腦缺血再灌注損傷大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of ROP on expression levels of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and c-Myc in rats with cerebral ischemiareperfusion injury

3 討論

本實驗通過構(gòu)建腦缺血再灌注大鼠模型，觀察ROP對腦缺血再灌注損傷的影響。跳臺實驗考察動物的被動記憶能力，Y迷宮實驗則研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力，該迷宮利用嚙齒類動物對新異環(huán)境天然探究的自然習(xí)性，不需要動物學(xué)習(xí)任何規(guī)則趨利避害，能有效反映動物對新異環(huán)境的識別記憶能力［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，CI/R組大鼠對新環(huán)境的識別能力降低，且犯錯次數(shù)增多，而ROP可增加大鼠對新環(huán)境的探索和記憶能力，并減少跳臺實驗犯錯次數(shù)。說明ROP可改善腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)是由小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及巨噬細胞激活釋放細胞因子和趨化因子介導(dǎo)外周炎癥細胞的浸潤形成的炎癥微環(huán)境［9］。小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可激活極化為M1、M2型小膠質(zhì)細胞［10］。調(diào)控小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M1型極化可加重腦損傷，向M2型極化可發(fā)揮腦保護作用［11］。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）是M1型標(biāo)志物，精氨酸酶1（Arg-1）是M2型標(biāo)志物。本文研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠外周血中M1含量及iNOS蛋白水平，升高M2含量及Arg-1蛋白表達水平的作用。提示ROP調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2型極化，對腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用。

炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮非常重要的作用，是造成腦組織再灌注損傷的主要因素，缺血腦組織中促炎細胞因子的大量表達促進炎癥反應(yīng)進程，加重腦組織的缺血再灌注損傷［12］。IL-6是白細胞介素家族中多功能的細胞因子，可通過減少炎癥因子的分泌或加強抗炎分子的表達，在腦缺血后，IL-6的表達活性增加，在腦缺血再灌注進展過程中起促進作用［13］。IL-10可上調(diào)炎癥因子拮抗劑的表達、抑制NF-κB活性，通過不同途徑抑制TNF-α和IL-1β活性，減少NO的合成和分泌，發(fā)揮抗炎效應(yīng)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠IL-6含量，升高IL-10含量的作用。提示ROP抑制炎癥因子的釋放改善腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷。

由于腦組織中含有大量的不飽和脂肪酸和高濃度的脂質(zhì)，抗氧化能力較弱，致使大腦容易受到氧自由基的損傷。機體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的穩(wěn)態(tài)被破壞而形成的氧化應(yīng)激狀態(tài)是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機制［15］。SOD、GSH屬于內(nèi)源性抗氧化酶，通過維持組織低濃度氧化劑和氧化還原平衡狀態(tài)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，MDA可反映脂質(zhì)過氧化程度與細胞損傷程度。陳人豪等［16］研究發(fā)現(xiàn)刺五加提取物通過升高SOD、GSH活性，降低MDA含量提高腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的抗氧化能力。本文研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有升高腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、GSH含量，降低MDA含量的作用。提示ROP通過抗氧化應(yīng)激對腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用。

凋亡是腦缺血再灌注損傷過程中的重要機制，抑制神經(jīng)元細胞凋亡可減輕腦缺血再灌注損傷［17］。促凋亡蛋白Bax為小分子細胞色素C提供通道，由線粒體進入胞質(zhì)而促進細胞凋亡，而Bcl-2蛋白能與Bax蛋白形成同源二聚體抑制Bax活性，關(guān)閉Bax通道而阻止小分子通過拮抗Bax促凋亡作用。Bcl-2/Bax可反映細胞凋亡情況［18］。Caspase家族是細胞凋亡的介導(dǎo)者及執(zhí)行者，Caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游，是家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點［19］。c-Myc是一種細胞原癌基因，通過調(diào)控細胞周期可誘導(dǎo)細胞增生，也可介導(dǎo)細胞凋亡［20］。高亮等［21］研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc在局灶性腦缺血再灌注大鼠模型中表達增加，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制，引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，ROP具有降低腦缺血再灌注損傷大鼠Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3，上調(diào)c-Myc蛋白表達水平的作用。提示ROP可抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元細胞凋亡。

綜上所述，ROP改善腦缺血再灌注大鼠病理損傷程度和學(xué)習(xí)記憶功能，其可能是通過抑制M1細胞極化改善免疫紊亂、抑制炎癥因子釋放抗氧化應(yīng)激和下調(diào)凋亡蛋白表達等實現(xiàn)的，且具有劑量依賴性。