·基礎(chǔ)免疫學(xué)·LncRNA CASC7/miR-98-5p/SIRT3軸調(diào)控慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞變化①

梁海梅 歐宗興 王蕾 陳忠仁

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，?？?570208）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種氣流受限的阻塞性肺部疾病，病死率逐年增高［1］。目前對(duì)COPD的治療方案多采取藥物+戒煙+心理治療，嚴(yán)重時(shí)需要吸氧并使用激素治療，影響患者的生活質(zhì)量［2-4］。

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）的異常表達(dá)被證實(shí)在包括COPD在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色［5］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了很多在COPD中起作用的LncRNAs，如LncRNA MCM3AP-AS1在COPD中 表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)MCM3AP-AS1能夠抑制支氣管平滑肌細(xì)胞（bronchial smooth muscle cells，BSMCs）增殖［6］；敲除LncRNA TUG1可減輕COPD的肺部炎癥損傷［7］。但仍然有很多LncRNAs在COPD中的作用不明確，LncRNA CASC7位于NC_000008.11染色體8，曾被證實(shí)可抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和侵襲，同時(shí)也可增強(qiáng)重癥哮喘患者對(duì)激素治療的敏感性［8-9］。miRNA也屬于非編碼RNA的一個(gè)亞類，目前對(duì)于miRNA的研究熱點(diǎn)在于被上游LncRNAs海綿化吸附，導(dǎo)致生物學(xué)功能被抑制。本研發(fā)現(xiàn)了CASC7與miR-98-5p堿基互補(bǔ)配對(duì)序列，而miR-98已經(jīng)被MUSRI等［10］證實(shí)在COPD患者中過(guò)表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)了miR-98-5p的下游靶基因沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Sirtuin3，SIRT3），既往研究報(bào)道SIRT3在COPD中可改善氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷［11］。

本研究旨在對(duì)CASC3在COPD中的作用進(jìn)行探討，并希望明確其具體調(diào)控機(jī)制，為COPD的診斷和治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本資料40例因肺癌切除術(shù)（不伴有COPD）切除的癌旁正常肺組織（距離原發(fā)灶邊緣至少2~5 cm，且肉眼可見(jiàn)無(wú)肺癌浸潤(rùn)），患者無(wú)吸煙史。其中男27例，女13例，年齡28~66歲。40例吸煙的非COPD健康志愿者，其中男30例，女10例，年齡31~72歲，煙齡7.3~18.1年，肺功能正常。2017年6月至2019年10月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院就診的60例患有COPD的吸煙患者，其中男45例，女15例，年齡35~68歲，煙齡7.6~17.9年。COPD患者均是首次診斷為COPD，同時(shí)不伴有其他嚴(yán)重性或慢性臨床疾病。每組志愿者均取肺組織和痰液標(biāo)本，在樣本收集之前所有志愿者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)，本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院附屬?？卺t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只C57BL/6J雄性大鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)學(xué)研究所，7周齡，體質(zhì)量（216±20）g。于20℃~25℃、濕度50%~65%下飼養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器脂多糖（LPS）由北京索萊寶科技有限公司提供；TRIzol試劑、胎牛血清、Lipofectamine3000試劑盒、miR-98-5p模擬物與抑制劑、酶標(biāo)儀、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、化學(xué)發(fā)光劑均由美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司提供；沉默SIRT3的siRNA質(zhì)粒由圣克魯斯生物技術(shù)有限公司提供；過(guò)表達(dá)CASC7的pcDNA3.1質(zhì)粒由湖南優(yōu)寶生物科技有限公司提供；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR SuperMix試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；CFX96Touch系統(tǒng)由美國(guó)伯樂(lè)公司提供；FISH試劑盒由廣州伯信生物科技有限公司提供；平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基由寧波明舟生物科技有限公司提供；pGL3載體由淼靈質(zhì)粒平臺(tái)提供；人IL-6、IL-8、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒由上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司提供；PI3K、p-PI3K、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記的IgG二抗均由英國(guó)Abcam提供；CCK-8試劑盒由上海漢恒生物科技有限公司提供；使用的紅玫瑰牌香煙由廣東卷煙廠提供，每支含焦油13 mg，尼古丁1.3 mg。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由上海前塵生物科技有限公司提供；流式細(xì)胞儀由貝克曼庫(kù)爾特提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與體內(nèi)轉(zhuǎn)染取12只C57BL/6J大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和COPD模型建立組。對(duì)照組置于無(wú)菌無(wú)煙環(huán)境下飼養(yǎng)。COPD組使用LPS灌胃，隨后在香煙煙霧（cigarette smoke，CS）室中暴露2個(gè)月（5 d/周，4次/d，2 h/次，8支/h）。每隔2周向大鼠鼻腔內(nèi)注射過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CASC7及陰性對(duì)照、miR-98-5p模擬物和miR-98-5p抑制劑以及相應(yīng)陰性對(duì)照；沉默質(zhì)粒si-SIRT3與陰性對(duì)照物。最后1次暴露結(jié)束24 h后，以100 mg/kg劑量給予戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取出肺組織。本研究所有程序均按照相關(guān)指導(dǎo)原則和規(guī)定進(jìn)行。

1.2.2 HE染色使用多聚甲醛固定左側(cè)肺葉組織，依次二甲苯脫水、梯度乙醇透明、浸蠟、包埋、切片，行HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 大鼠BSMCs的分離與轉(zhuǎn)染急性酶分離法分離BSMCs，首先將生理緩沖液預(yù)冷，取出大鼠肺臟后置于其中，通入混合氣體（O2∶CO2=19∶1），將支氣管主干分離，在解剖顯微鏡下再將肺動(dòng)、靜脈、間質(zhì)組織、結(jié)締組織及神經(jīng)纖維等剝離，最后去除上皮組織。將處理好的氣管平滑肌置于生理緩沖液并剪碎（1 mm×1 mm），加入膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、NaCl、KCl、MgCl2、葡萄糖配制成的消化液中，1 h后終止消化得到BSMCs，并重懸，接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h左右細(xì)胞融合度變?yōu)?0%~90%，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine3000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 qRT-PCR TRIzol試劑用于提取組織和血漿樣本中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成第一鏈cDNA，最后再使用qRT-PCR SuperMix試劑盒在CFX96 C1000系統(tǒng)上完成定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，使用U6和GAPDH將數(shù)據(jù)規(guī)范化。本實(shí)驗(yàn)使用的引物由北京博爾邁生物技術(shù)有限公司提供，序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5 亞細(xì)胞定位加入4%多聚甲醛將細(xì)胞固定于6孔板，使用1 ml DEPC水洗滌2次，5 min/次；向孔板中加入1 ml/孔的通透液，10 min后棄掉通透液并使用PBS洗滌3次，5 min/次；加入蛋白酶K工作液，使其與細(xì)胞均勻接觸，孵育10 min，PBS洗滌2次，5 min/次，經(jīng)多聚甲醛再固定與梯度乙醇脫水，干燥后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。在處理好的樣本上滴加20 μl的預(yù)雜交液，37℃下封閉孵育30 min，在冰上將探針與雜交液（1∶40）混合成雜交反應(yīng)液，滴加30μl雜交反應(yīng)液于樣本，73℃下反應(yīng)5 min，最后在37℃過(guò)夜孵育。經(jīng)2×SSC洗滌后加入DAPI進(jìn)行染核，封片后使用共聚焦顯微鏡拍照觀察。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)報(bào)告載體pGL3上插入CASC7野生型、突變型序列（CASC7-WT、CASC7-MUT）和SIRT3野生型、突變型（SIRT3-WT、SIRT3-MUT）序列的3'UTR端，將293T細(xì)胞植入孔板，再使用Lipofectamine3000試劑將克隆好的報(bào)告載體與miR-98-5p NC、miR-98-5p mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，靜置48 h后，應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為標(biāo)準(zhǔn)化參考。

1.2.7 ELISA應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)BSMCs上清液和大鼠血清中的IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平，簡(jiǎn)單步驟如下：孔板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔中加入50μl樣本，再向標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔中同時(shí)加入100μl HRP標(biāo)記的待測(cè)抗體，封閉孔板，37℃下孵育60 min。洗滌干燥后向孔中加入底物，37℃暗室中孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的OD值。

1.2.8 Western blot細(xì)胞經(jīng)過(guò)RIPA裂解液完全裂解后，得到的產(chǎn)物為總蛋白樣本，蛋白經(jīng)BCA試劑盒定量后，加熱變性，SDS-PAGE分離蛋白，再將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并使用5%脫脂牛奶對(duì)其封閉1 h，加入PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗，膜上孵育，4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，膜上加入HRP標(biāo)記的IgG（1∶5 000）二抗孵育，2 h后加入化學(xué)發(fā)光劑（ECL）將蛋白條帶信號(hào)放大，并分析條帶灰度值，以GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化。

1.2.9 CCK-8將待測(cè)細(xì)胞重懸，密度調(diào)整為2×104個(gè)/ml，植入96孔板，2×103個(gè)/孔，放入培養(yǎng)箱中，每隔24 h使用CCK-8溶液檢測(cè)1次細(xì)胞存活狀態(tài)，直至培養(yǎng)到96 h進(jìn)行最后1次檢測(cè)。測(cè)量450 nm處吸光度值，繪制成曲線。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡程度使用Annexin VFITC/PI雙染色法檢測(cè)，孔板中以每孔2×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞在緩沖液中重懸，加入Annexin V-FITC和PI染色液，孵育30 min，細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)采用±s的形式統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并采用SPSS22.0和GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析。兩組間差異使用t檢驗(yàn)，多組間差異使用單因素分析法，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC7在COPD中表達(dá)降低，miR-98-5p表達(dá)升高qRT-PCR檢測(cè)收集的臨床樣本，結(jié)果顯示，與非吸煙者的肺組織相比，非COPD吸煙者和COPD患者肺組織中CASC7表達(dá)降低，miR-98-5p表達(dá)上升（均P<0.05），且CASC7與miR-98-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.503 4，P<0.000 1，圖1A~C）。檢測(cè)痰液標(biāo)本也得到與組織標(biāo)本相同的結(jié)果（圖1D~F）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本中CASC7和miR-98-5p的表達(dá)Fig.1 Expressions of CASC7 and miR-98-5p in clinical specimens was detected by qRT-PCR

2.2 COPD大鼠模型評(píng)估通過(guò)HE染色觀察COPD大鼠的肺組織，評(píng)估建模情況。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示，與正常大鼠肺組織相比，COPD大鼠的肺泡壁變厚，面積增大，血管增多，支氣管的管壁增厚，黏液腺增生，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛倒伏，上皮結(jié)構(gòu)紊亂。以上都符合COPD的特征，說(shuō)明模型建立成功（圖2）。

圖2 HE染色結(jié)果（×200）Fig.2 HE staining results（×200）

2.3 COPD大鼠肺組織中CASC7表達(dá)降低，miR-98-5p表達(dá)增高，且PI3K通路被激活成功建立COPD大鼠模型后，檢測(cè)大鼠肺組織中RNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康大鼠相比，COPD大鼠中CASC7的表達(dá)降低，miR-98-5p表達(dá)升高（圖3A），且PI3K的mRNA與p-PI3K蛋白表達(dá)增高（圖3B~D），說(shuō)明PI3K通路被激活（均P<0.05）。

圖3 肺組織中CASC7、miR-98-5p、PI3K表達(dá)水平Fig.3 Expressions of CASC7，miR-98-5p and PI3K in lung tissue

2.4 過(guò)表達(dá)CASC7能抑制COPD大鼠血清中炎癥因子表達(dá)在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)CASC7的pcDNA3.1質(zhì)粒，觀察CASC7對(duì)大鼠血清中炎癥因子的作用。ELISA結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)CASC7可抑制炎癥因子分泌（均P<0.05，表2）。

表2 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.2 IL-6，IL-8，TNF-α expression levels were detected by ELISA（±s，pg/ml）

表2 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平（±s，pg/ml）Tab.2 IL-6，IL-8，TNF-α expression levels were detected by ELISA（±s，pg/ml）

Note：Compared with pcDNA3.1，1）P<0.05.

Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-CASC7 IL-6 236.6±18.2 117.1±12.31）IL-8 107.0±8.0 36.0±2.01）TNF-α 37.0±2.0 11.0±5.01）

2.5 過(guò)表達(dá)CASC7可抑制BSMCs上清液中炎癥因子的分泌和BSMCs細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)BSMCs凋亡ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)CASC7可使炎癥因子分泌減少（均P<0.05，圖4A）；CCK8和流式細(xì)胞術(shù)顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)CASC7可抑制BSMCs的增殖并誘導(dǎo)其凋亡（均P<0.05，圖4B~D）。

圖4 過(guò)表達(dá)CASC7對(duì)BSMCs的生物學(xué)作用Fig.4 Biological effects of CASC7 overexpression on BSMCs

2.6 CASC7作為miR-98-5p的分子海綿發(fā)揮作用通過(guò)亞細(xì)胞定位網(wǎng)站（http：//lncatlas.crg.eu/）和FISH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出CASC7在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)更高，說(shuō)明CASC7可以作為ceRNA發(fā)揮功能（圖5A）；在lncRNASNP2（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lnc-RNASNP/#！/）中發(fā)現(xiàn)CASC7與miR-98-5p的結(jié)合位點(diǎn)（圖5B），在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者存在靶向關(guān)系（圖5C），CASC7可以作為miR-98-5p的分子海綿。

圖5 CASC7和miR-98-5p的靶向關(guān)系鑒定Fig.5 Identification of targeting relationship between CASC7 and miR-98-5p

2.7 miR-98-5p通過(guò)直接靶向SIRT3調(diào)控PI3K信號(hào)通路通過(guò)RNA22網(wǎng)站（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）預(yù)測(cè)了miR-98-5p的下游靶基因SIRT3，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明miR-98-5p可靶向調(diào)控SIRT3（圖6A、B）。檢測(cè)SIRT3在臨床組織樣本中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與非吸煙者的肺組織相比，非COPD吸煙者和COPD患者的肺組織中SIRT3表達(dá)降低，痰液標(biāo)本檢測(cè)也得到相同結(jié)果（均P<0.05，圖6C、D）。經(jīng)分析得出miR-98-5p與SIRT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.883 7，P<0.000 1，圖6E）。Western blot檢測(cè)p-PI3K蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-98-5p可明顯上調(diào)p-PI3K蛋白表達(dá)，抑制miR-98-5p表達(dá)則可下調(diào)p-PI3K蛋白表達(dá)（圖6F、G）。

圖6 miR-98-5p、SIRT3、PI3K關(guān)系驗(yàn)證Fig.6 miR-98-5p，SIRT3，PI3K relationship verification

2.8 改變SIRT3可部分抑制CASC7或miR-98-5p對(duì)大鼠血清炎癥因子表達(dá)的影響與miR-98-5p in?hibitor+si-NC組 相 比，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平上升，說(shuō)明沉默SIRT3可以部分抑制下調(diào)miR-98-5p對(duì)炎癥因子分泌的影響作用；與CASC7+si-NC組相比，CASC7+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平均上升（均P<0.05，圖7），提示沉默SIRT3也可以部分挽救CASC7的作用。

圖7 ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of IL-6，IL-8 and TNF-α were detected by ELISA

2.9 敲低SIRT3可以部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)CASC7或miR-98-5p抑制劑對(duì)BSMCs的作用ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組各因子的表達(dá)均被促進(jìn)（均P<0.05）；相較于CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)均上升（均P<0.05，圖8A~C）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P<0.05），較CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組的細(xì)胞增殖被促進(jìn)（P<0.05，圖8D）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，較miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組的細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）；較CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組的細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05，圖8E）；Western blot結(jié)果顯示，與miR-98-5p inhibitor+si-NC組相比，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組p-PI3K蛋白表達(dá)升高（P<0.05），與CASC7+si-NC組相比，CASC7+si-SIRT3組p-PI3K表達(dá)升高（P<0.05，圖8F）。提示si-SIRT3可以部分逆轉(zhuǎn)miR-98-5p inhibitor或CASC7對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響（圖8G）。

圖8 敲低SIRT3能影響過(guò)表達(dá)CASC7或miR-98-5p抑制劑對(duì)BSMCs的作用Fig.8 Knocking down SIRT3 could affect effect of overex?pressed CASC7 or miR-98-5p inhibitor on BSMCs

3 討論

本研究從分子生物學(xué)角度探究了CASC7在COPD進(jìn)展中的作用，發(fā)現(xiàn)其能夠與miR-98-5p競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合進(jìn)而抑制SIRT3表達(dá)，改善COPD大鼠氣道炎癥反應(yīng)及BSMCs增殖。

COPD發(fā)病的主要原因是氣道炎癥，且小氣道炎癥也是COPD的主要病變部位，該過(guò)程會(huì)使大量炎癥細(xì)胞浸出，同樣也會(huì)釋放大量IL-6、IL-8、TNF-α，導(dǎo)致氣流受限，最終還會(huì)引起肺纖維化［12-13］。中性粒細(xì)胞的增多是COPD的中心環(huán)節(jié)，IL-6可抑制中性粒細(xì)胞凋亡，推進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖，而IL-8與IL-6的分泌也具有相關(guān)性［14］。另外肺泡巨噬細(xì)胞在COPD中的增多也可間接導(dǎo)致肺組織損傷，肺泡巨噬細(xì)胞也促進(jìn)了TNF-α的產(chǎn)生，TNF-α在肺氣腫的發(fā)生中占有重要地位［15］。氣道炎癥也會(huì)引起氣道管壁增厚，支氣管氣道平滑肌的增生肥大，從而導(dǎo)致氣道重構(gòu)，氣道重構(gòu)是COPD具有標(biāo)志性的病理變化［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC7在COPD中低表達(dá)，且過(guò)表達(dá)CASC7抑制了IL-6、IL-8、TNF-α的分泌，抑制BSMCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可見(jiàn)CASC7能夠?qū)獾姥装Y起保護(hù)作用，并通過(guò)抑制BSMCs的增殖來(lái)抑制氣道管壁增厚現(xiàn)象。既往研究表明，LncRNA CASC7在肺癌中發(fā)揮抑癌因子作用［8］。此外，CASC7在哮喘中也發(fā)揮保護(hù)作用，能夠改善嚴(yán)重哮喘的進(jìn)展［9］。本研究則進(jìn)一步證實(shí)了CASC7在COPD進(jìn)展中的影響及其保護(hù)功能。

很多研究證明LncRNAs作為miRNAs的分子海綿，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種發(fā)展過(guò)程。本研究利用生物學(xué)網(wǎng)站和FISH實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CASC7可以海綿吸附miR-98-5p。miR-98-5p在肺部疾病中的作用已被證實(shí)。MUSRI等［10］研究了COPD中多種miRNAs的異常表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-98在COPD患者中上調(diào)。本課題組通過(guò)實(shí)驗(yàn)也得到了在COPD中miR-98-5p表達(dá)上調(diào)的結(jié)論，還發(fā)現(xiàn)miR-98-5p與CASC7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在COPD中發(fā)揮促進(jìn)疾病發(fā)展的作用。而后課題組又發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了miR-98-5p的下游靶基因SIRT3。SIRT3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；傅囊环N，存在于線粒體中，并在正常組織中廣泛表達(dá)，被認(rèn)為是細(xì)胞保護(hù)性Sirtuin［17］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡與壞死，也可抑制COPD氣道上皮線粒體氧化應(yīng)激，改善細(xì)胞損傷［11，18］。另外一項(xiàng)研究顯示，COPD患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低［19］。本研究發(fā)現(xiàn)SIRT3在COPD中表達(dá)下調(diào)，并且可以被CASC7/miR-98-5p軸調(diào)控，過(guò)表達(dá)CASC7或miR-98-5p抑制劑對(duì)炎癥因子和BSMCs的抑制作用均可被沉默SIRT3反轉(zhuǎn)，SIRT3在COPD中發(fā)揮保護(hù)作用。

另外已有研究表明，SIRT3與人磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號(hào)通路相關(guān)，有研究表明人參皂苷Rg3和補(bǔ)肺益腎Ⅱ號(hào)方都能有效抑制PI3K活性，緩解COPD的癥狀［20-22］。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-98-5p可以通過(guò)SIRT3影響PI3K活性，進(jìn)而參與COPD的發(fā)展。

本研究從氣道炎癥和BSMCs的角度探討了CASC7在COPD中的生物學(xué)功能，可能為COPD的預(yù)防與治療發(fā)現(xiàn)了新的生物標(biāo)志物，并提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。