木蘭花堿通過(guò)ROS/KRAS/AMPK抑制結(jié)直腸癌sw480細(xì)胞干性特征和糖酵解①

劉璨 劉艾鑫 姜昌鎬

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，延吉 133000）

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率和病死率分別排第3位和第5位，且呈逐年上升趨勢(shì)［1］。盡管目前針對(duì)結(jié)直腸癌臨床已有較為系統(tǒng)的治療方案，如放療、化療等，但耐藥性及較強(qiáng)的副作用嚴(yán)重降低患者的生存率和生存質(zhì)量。木蘭花堿（magnoflorine，Mag）屬于阿樸啡類(lèi)生物堿，廣泛存在于防己科等藥用植物中，具有抗氧化、降血糖等藥理作用［2］。此外，研究表明Mag能夠抑制胃癌進(jìn)展并通過(guò)AKT/mTOR和p38信號(hào)通路提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物敏感性［3-4］。然而Mag對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以不同濃度Mag處理人結(jié)直腸癌sw480細(xì)胞，觀察Mag對(duì)結(jié)直腸細(xì)胞干性及糖酵解的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞株sw480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；Mag購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶；活性氧誘導(dǎo)劑購(gòu)自貝博生物有限公司；葡萄糖和乳酸試劑盒購(gòu)自Sigma；CD133（64326）、p-AMPK（2537）、AMPK（5831）、KRAS（53270）和GAPDH（5174）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。電泳儀及電泳槽（E-C Apparatus Corporation，美國(guó)）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀、Cytation5熒光成像系統(tǒng)和Gel Doc凝膠成像儀（Bio-Rad，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sw480細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右后，按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的Mag（0、10、20、40 μmol/L），分別于24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑（10 μl/孔），2 h后測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制各組細(xì)胞OD值變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 球體形成實(shí)驗(yàn)sw480細(xì)胞經(jīng)不同濃度Mag處理48 h后，以3 000個(gè)/孔接種于低黏附6孔板中。DMEM/F12培養(yǎng)液（含20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF和10 μl/ml B27）培養(yǎng)2周，分別于第1、7、14天拍照，并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)量。

1.2.3 球體免疫熒光實(shí)驗(yàn)收集成球細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100通透以及3%BSA封閉后，加入CD133抗體（1∶200）孵育2 h，PBS清洗后，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗。含DAPI抗熒光淬滅封片劑封片后，Cytation5熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.4 糖酵解檢測(cè)實(shí)驗(yàn)sw480細(xì)胞經(jīng)不同濃度Mag處理24 h后，分別提取蛋白，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)sw480細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)不同濃度Mag處理后，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃孵育30 min后，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞碎片進(jìn)行裂解，每孔30 μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳（120 V、90 min）根據(jù)分子量分離蛋白樣品，然后在300 mA、60 min條件下，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉2 h后，分別加入抗體p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、KRAS（1∶2 000）和GAPDH（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST清洗3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶8 000）室溫孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mag對(duì)sw480細(xì)胞活性的影響以不同濃度梯度的Mag處理sw480細(xì)胞，并通過(guò)CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性變化結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組（Mag 0 μmol/L）相比，Mag給藥組（10、20、40 μmol/L）細(xì)胞活性在24 h、48 h和72 h均明顯降低。

表1 各組細(xì)胞OD480 nm值比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

表1 各組細(xì)胞OD480 nm值比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

Note：Compared with Mag control（0 μmol/L）group，1）P<0.01，2）P<0.001.

Groups Mag 0 μmol/L Mag 10 μmol/L Mag 20 μmol/L Mag 40 μmol/L 24 h 0.93±0.049 0.69±0.0501）0.61±0.0302）0.52±0.0302）48 h 1.33±0.08 0.85±0.041）0.75±0.031）0.63±0.022）72 h 1.95±0.05 1.13±0.052）0.89±0.042）0.77±0.052）

2.2 Mag對(duì)sw480細(xì)胞球體形成大小和數(shù)量的影響Mag處理后，球體形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第7天各組細(xì)胞球體形成數(shù)量分別為193.67±8.74、129.67±12.22、95.67±13.32、54.67±7.37。第14天球體形成 數(shù) 量 分 別 為406.67±20.40、226.33±25.15、14.33±17.62、83.00±10.15。與對(duì)照組相比，Mag給藥組球體形成大小和數(shù)量均降低，表明Mag能夠抑制sw480細(xì)胞球體形成能力。見(jiàn)圖1。

圖1 Mag對(duì)sw480細(xì)胞球體形成大小和數(shù)量的影響Fig.1 Effect of Mag on size and number of sw480 spheroids

2.3 Mag對(duì)sw480球體細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)的影響收集各組球體細(xì)胞，球體免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD133蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Mag給藥組球體細(xì)胞減小、熒光強(qiáng)度減弱，提示Mag抑制sw480球體細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)（圖2）。

圖2 Mag對(duì)sw480球體細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Mag on CD133 protein expression in sw480 spheroid cells

Note：Compared with Control group，**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1.

2.4 Mag對(duì)sw480細(xì)胞糖酵解的影響不同濃度Mag處理24 h后收集細(xì)胞，比色法分別檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸生成。結(jié)果表明，各組細(xì)胞葡萄糖攝取量分別為（10.32±1.12、7.11±0.86、4.60±0.75、2.93±0.31）nmol/μg。各組乳酸生成量分別為（7.62±0.69、5.57±0.59、3.95±0.47、2.25±0.28）nmol/μg。與對(duì)照組相比，Mag處理后，細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸生成均降低（P<0.01，P<0.001或P<0.000 1），提示Mag抑制sw480細(xì)胞糖酵解（圖3）。

2.5 Mag對(duì)sw480細(xì)胞ROS水平的影響Mag處理后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度（×103）分別為53.44±3.76、38.20±3.17、21.94±3.10、13.00±5.66。與對(duì)照組相比，Mag給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低（F=58.32，P<0.000 1），提示Mag抑制sw480細(xì)胞內(nèi)ROS水平（圖4）。

圖4 Mag對(duì)sw480細(xì)胞ROS的影響Fig.4 Effect of Mag on ROS in sw480 cells

2.6 Mag對(duì)sw480細(xì)胞KRAS/AMPK信號(hào)通路的影響Mag及活性氧誘導(dǎo)劑（RA）處理后，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)KRAS/AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Mag處理后細(xì)胞內(nèi)KRAS和p-AMPK表達(dá)水平均降低（P<0.01）。與Mag組相比，Mag和RA聯(lián)合處理組KRAS和p-AMPK表達(dá)水平升高（P<0.05）。提示Mag通過(guò)降低ROS水平抑制KRAS/AMPK信號(hào)通路（圖5）。

圖5 Mag對(duì)sw480細(xì)胞KRAS/AMPK信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of Mag on KRAS/AMPK signaling pathway in sw480 cells

3 討論

盡管癌癥治療取得了重大進(jìn)展，但患者的存活率仍然很低。標(biāo)準(zhǔn)抗癌療法不充分的療效和嚴(yán)重的副作用引起了研究者對(duì)天然藥物的興趣，以確定具有良好化療性能的植物來(lái)源的生物活性化合物。Mag是一種廣泛存在于多種植物中的四元阿樸啡生物堿，OKON等［5］發(fā)現(xiàn)Mag對(duì)肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤和橫紋肌肉瘤細(xì)胞均具有抑制作用。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新、自我修復(fù)能力的永生化增殖性細(xì)胞亞群，與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移、化療耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)［6-7］。WANG等［8］研究表明蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞干性發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌的抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Mag能夠抑制sw480細(xì)胞活性及成球能力并下調(diào)其球體細(xì)胞中CD133的表達(dá)，表明Mag可能通過(guò)調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞干性特征抑制其增殖。

最近，代謝重編程被認(rèn)為是癌細(xì)胞的核心特征，其中最受關(guān)注的有氧糖酵解也被稱(chēng)為Warburg效應(yīng)。在糖酵解過(guò)程中，癌細(xì)胞增加葡萄糖消耗以滿(mǎn)足快速生長(zhǎng)所需的高能量和大分子需求，驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)Mag處理后，sw480細(xì)胞葡萄糖攝取及乳酸生成水平明顯下降，表明Mag能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞糖酵解。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在更高水平的ROS，從而維持生物學(xué)活動(dòng)。腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖伴隨高ROS的產(chǎn)生，盡管ROS具有一定的細(xì)胞毒性，但腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)這種氧化負(fù)荷并茁壯成長(zhǎng)。此外，腫瘤細(xì)胞通過(guò)增加其抗氧化狀態(tài)以?xún)?yōu)化細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)增殖的促進(jìn)，同時(shí)避免觸發(fā)衰老、細(xì)胞凋亡或鐵死亡［11］。MOLONEY等［12］研究表明癌細(xì)胞中高水平的ROS可通過(guò)減弱PTEN和MAPK磷酸酶活性來(lái)刺激增殖和細(xì)胞存活。為了維持高ROS水平對(duì)增殖的促進(jìn)作用，同時(shí)降低衰老或細(xì)胞死亡的風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種方式上調(diào)抗氧化轉(zhuǎn)錄因子和/或重新編程代謝［11-12］。研究表明，癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平與干性特征及細(xì)胞代謝均密切相關(guān)［13］。致癌基因KRAS可誘導(dǎo)多種癌癥的表型特征，包括干性特征增強(qiáng)及細(xì)胞代謝改變［14-15］。AMPK是一種保守的能量傳感器，是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)劑。研究表明，ROS/KRAS/AMPK信號(hào)能夠促進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌干細(xì)胞特性中的作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)Mag能夠抑制sw480細(xì)胞中的ROS水平，并通過(guò)抑制ROS抑制KRAS/AMPK信號(hào)通路，表明Mag能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中ROS/KRAS/AMPK信號(hào)通路。

綜上所述，Mag能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞sw480的干性特征及糖酵解水平，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中ROS/KRAS/AMPK信號(hào)通路有關(guān)。