基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葉下珠作用機(jī)制分析

潘新波，薩日娜，趙麗娟，張 偉，李彩東*

(1.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

葉下珠(PhyllanthusurinariaL.)為大戟科葉下珠屬植物, 藥用全草，是我國傳統(tǒng)中草藥。有平肝清熱、利水解毒之功效，民間多用來治療小兒疳積、腸炎、尿路感染和黃疸肝炎等病癥[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)葉下珠的基礎(chǔ)研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及機(jī)制，臨床研究主要集中在抗乙肝病毒、抗肝細(xì)胞纖維化、改善肝功能及抗腫瘤等方面[2,3]，有關(guān)其抗腫瘤、抗血栓及抗氧化等作用的研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠化學(xué)成分豐富，藥理作用顯著[4,5]，是一種值得深入開發(fā)的天然藥物[6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助化合物、蛋白、疾病以及生物信息注釋等多個(gè)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建葉下珠化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，從分子水平預(yù)測并探討葉下珠的藥理作用機(jī)制，為更有針對(duì)性地深入開展葉下珠的實(shí)驗(yàn)研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 化合物的收集

以“葉下珠”“PhyllanthusurinariaL.”“Phyllanthusurinaria”或“PhyllanthusurinariaLinn.”為關(guān)鍵詞檢索中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)、萬方數(shù)據(jù)庫(www.wanfangdata.com.cn)、PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Springer(https://link.springer.com/)、Elsevier(https://www.elsevier.com/en-xs)、Wiley Online Library(https://onlinelibrary.wiley.com/)和Taylor & Francis Online(https://www.tandfonline.com/)等中英文引文數(shù)據(jù)庫，并對(duì)中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(http://www.pharmdata.ac.cn/cnpconline/)、臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫(http://tcm.cmu.edu.tw/)、TCMSP(http://tcmspw.com/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢，檢索日期截止至2020年9月30日，收集葉下珠中所含化合物。

1.2 化合物篩選

根據(jù)藥物的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)相關(guān)特性，以Lipinski五規(guī)則作為評(píng)估類藥性的重要指標(biāo)[7-8]，另結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)未納入篩選標(biāo)準(zhǔn)但已有報(bào)道葉下珠中具有生物活性和藥理作用的化合物進(jìn)行收集。將化合物信息在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索，獲得相應(yīng)的SMILES結(jié)構(gòu)式。

1.3 化學(xué)物靶點(diǎn)預(yù)測及化合物-靶點(diǎn)通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集的葉下珠中化合物SMILES結(jié)構(gòu)式，分別采用TCMSP、TCMID、CHEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、SWISS(http://www.swisstargetprediction.ch/)(probability≥0.7)、STICH(http://stitch.embl.de/)(score≥0.7)在線靶標(biāo)預(yù)測平臺(tái)進(jìn)行檢索[9]，預(yù)測靶標(biāo)蛋白，在NCBI和Uniprot數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)化基因名，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建葉下珠化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與靶標(biāo)分析

通過STRING(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，蛋白種屬設(shè)置為“Homosapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等“medium confidence”(0.4)，其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。采用Cytoscape 3.7.2中CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯远戎行男?DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)和局部邊連通性(LAC)為指標(biāo)，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，篩選DC≥2倍中位數(shù)，BC、CC、EC、NC、LAC分別≥1倍中位數(shù)的靶點(diǎn)，作為葉下珠發(fā)揮治療作用的候選靶點(diǎn)，并構(gòu)建候選靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytohubba插件獲取degree值分別前10的Hub靶點(diǎn)和葉下珠發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分[10]。

1.5 預(yù)測候選靶點(diǎn)與疾病分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TCMSP、DisGenet(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/search)、DrugBan(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、CTD(http://ctdbase.org/)和PubMed中收集葉下珠候選靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病，將候選靶標(biāo)蛋白和對(duì)應(yīng)疾病構(gòu)建候選靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，選取degree值≥2倍中位數(shù)的對(duì)應(yīng)疾病并進(jìn)行分析。

1.6 靶標(biāo)通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)輸入所篩選的葉下珠10個(gè)Hub靶點(diǎn)，設(shè)定閾值P<0.01，進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和基因功能(KEGG)通路富集分析，通過Omicshare Tools 3.0在線繪圖網(wǎng)站(http://www.omicshare.com/)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將所篩選葉下珠degree值前10的關(guān)鍵成分及Hub蛋白、“1.6”項(xiàng)下富集篩選后的KEGG信號(hào)通路及“1.5”項(xiàng)下篩選后的疾病，采用Cytoscape 3.7.2軟件中Merge功能構(gòu)建葉下珠關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析探討葉下珠化合物、靶點(diǎn)和信號(hào)通路在治療相關(guān)疾病的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 化合物收集及篩選

截止2020年9月30日，共檢索出相關(guān)文獻(xiàn)502篇，結(jié)合數(shù)據(jù)庫查詢，收集葉下珠中356個(gè)化合物。以Lipinski五規(guī)則作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻(xiàn)共納入205個(gè)化合物，在PubChem數(shù)據(jù)庫獲得相應(yīng)的SMILES結(jié)構(gòu)式。

2.2 靶點(diǎn)獲取、化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集的205個(gè)化合物采用TCMSP、TCMID、CHEMBL、SWISS、STICH在線靶標(biāo)預(yù)測平臺(tái)檢索，共有154個(gè)化合物匹配到651個(gè)靶標(biāo)蛋白，在Uniprot中標(biāo)準(zhǔn)化基因名，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1-A，另將651個(gè)靶點(diǎn)通過STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1-B。采用Cytoscape 3.7.2中CytoNCA插件分析所得PPI網(wǎng)絡(luò)，按照“1.4”項(xiàng)下指標(biāo)篩選，共得到36個(gè)候選靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)葉下珠中82個(gè)化合物，具體信息見表1，圖2為36個(gè)候選靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。以候選靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化學(xué)成分構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3-A。以degree值篩選度值前10的Hub蛋白，依次為PTGS2，HSP90AA1，CASP3，ESR1，TNF，AKT1，MMP9，JUN，MTOR，PPARG，葉下珠發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分按度值大小依次為Pu31、Pu1、Pu40、Pu39、Pu6、Pu139、Pu30、Pu10、Pu8和Pu11，即(-)-Epigallocatechin gallate(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、quercetin(槲皮素)、Luteolin(木犀草素)、Fisetin(非瑟酮)、ellagic acid(鞣花酸)、Eupatilin(異澤蘭黃素)、(-)-Epicatechin(表兒茶素)、rutin(蕓香苷)、kaempferol(山柰酚)、Corilagin(柯里拉京)。

注：A.154個(gè)化合物-651個(gè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖；B.651個(gè)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

圖2 葉下珠中36個(gè)候選靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

注：A.36個(gè)候選靶點(diǎn)-82個(gè)化合物網(wǎng)絡(luò)圖；B.degree值篩選前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 葉下珠中候選化合物信息

2.3 預(yù)測候選靶點(diǎn)與疾病、疾病靶點(diǎn)的篩選

將36個(gè)候選靶點(diǎn)分別在TCMSP、DisGenet、DrugBank、OMIM、TTD、CTD和PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得葉下珠36個(gè)候選靶點(diǎn)匹配的疾病299種，構(gòu)建靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)Ⅰ，見圖4。為更為直觀探討分析葉下珠治療疾病的機(jī)制，本研究對(duì)其10個(gè)關(guān)鍵Hub靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的227種疾病構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)-對(duì)應(yīng)疾病網(wǎng)絡(luò)Ⅱ，見圖5，以degree值≥2倍中位數(shù)(n=1)，即degree≥2為篩選條件，收集葉下珠發(fā)揮治療作用的候選疾病97種，與相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白重新構(gòu)建靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)Ⅲ，見圖6。

注：節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比例關(guān)系。

注：節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比例關(guān)系。

2.4 靶標(biāo)通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫中GO功能富集分析結(jié)果見圖7，以P<0.01為篩選條件，得到GO條目37個(gè)，其中BP(生物過程)條目29個(gè)、CC(細(xì)胞組分)條目2個(gè)、MF(分子功能)條目6個(gè)，分別占78.4%、5.4%、16.2%，其納入條目主要分為基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄翻譯、增殖凋亡、糖皮質(zhì)激素、雌激素、含氮物質(zhì)代謝及代謝調(diào)控等方面。

圖7 葉下珠10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析

KEGG Pathways分析篩選得到24條通路(P<0.01)，以疾病相關(guān)程度和P值進(jìn)行篩選，其中基因數(shù)目≥4的通路有9條，見圖8，主要涉及癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、癌癥蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、雌激素(Estrogen signaling pathway)、乙肝(Hepatitis B)等信號(hào)通路。

注：Rich factor值越大，表明通路富集程度越高；點(diǎn)的大小表示富集到的靶點(diǎn)數(shù)量。

2.5 關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

所構(gòu)建的葉下珠關(guān)鍵成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖9。葉下珠以(-)-Epigallocatechin gallate、quercetin、Luteolin、Fisetin、ellagic acid、Eupatilin、(-)-Epicatechin、rutin、kaempferol和Corilagin為關(guān)鍵成分，作用于PTGS2、TNF等10個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，主要通過調(diào)控Pathways in cancer、TNF signaling pathway、Proteoglycans in cancer和Estrogen signaling pathway等信號(hào)通路，發(fā)揮治療Colonic Neoplasms、Inflammation、Adenocarcinoma、Liver Neoplasms等17種不同疾病的作用。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，通過圖9分析結(jié)果，本文預(yù)測了葉下珠中特征性成分發(fā)揮治療疾病的作用機(jī)制，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，Corilagin、(-)-Epicatechin和(-)-Epigallocatechin gallate主要通過PTGS2、TNF和HSP90AA1靶點(diǎn)，調(diào)控Pathways in cancer、TNF signaling pathway及T cell receptor signaling pathway和Toll-like receptor signaling pathway信號(hào)通路，治療結(jié)腸腫瘤、腺癌、前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、肝腫瘤和乳腺癌及炎癥的作用，ellagic acid通過AKT1、MMP9靶點(diǎn)，調(diào)控Prostate cancer、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway及Pathways in cancer信號(hào)通路，發(fā)揮治療前列腺腫瘤、膀胱癌、結(jié)腸腫瘤及炎癥的作用；此外，Corilagin、(-)-Epigallocatechin gallate可能通過TNF靶點(diǎn)，調(diào)控MAPK signaling pathway信號(hào)通路，治療心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化和腦缺血，且上述三種化合物還可通過TNF靶點(diǎn)，調(diào)控TNF signaling pathway信號(hào)通路，治療再灌注損傷。其他非特征性成分Fisetin、Luteolin、quercetin、rutin和kaempferol可通過作用于TNF、PTGS2、AKT1及MMP9，發(fā)揮抗炎、抗癌作用。Fisetin、quercetin、Luteolin、kaempferol、rutin及Eupatilin可作用于TNF、CASP3和JUN，發(fā)揮抗氧化、抗血栓的作用，可治療心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、腦損傷和阿爾茲海默病等。Quercetin、kaempferol、Luteolin和Eupatilin可作用于PPARG，治療結(jié)腸腫瘤、Ⅱ型糖尿病、腺癌、肝腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾茲海默病等。

表2 葉下珠主要藥理作用機(jī)制分析

注：波浪線箭頭代表近幾年葉下珠特征性成分新的藥理作用機(jī)制預(yù)測；虛線箭頭代表葉下珠特征性成分主要藥理作用機(jī)制預(yù)測；三角形代表特征性化合物；菱形代表degree值前5的信號(hào)通路；倒三角箭頭代表所主要治療疾??；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比例關(guān)系。

3 討論

葉下珠具有利水解毒、平肝清熱功效，作為利尿劑和解毒劑在全球亞熱帶區(qū)域國家均有使用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)葉下珠在抗乙型肝炎病毒、保肝護(hù)肝、抗腫瘤、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓等藥理作用研究方面均取得一定進(jìn)展[11-12]。由于該藥物資源豐富，提取物低毒性[13]，未見不良反應(yīng)報(bào)道，故應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。

本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了葉下珠活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)預(yù)測了葉下珠發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，即10種化合物，10個(gè)潛在關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，24條信號(hào)通路和17種疾病。既往研究表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過影響多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的多個(gè)靶分子，抑制腫瘤血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移，具有細(xì)胞周期抑制和促凋亡作用[14]。槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗炎、抗癌防癌、抗菌、抗病毒及預(yù)防和治療心血管疾病等多種生物活性及藥理作用[15-17]。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗過敏、抗纖維化、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)和心臟保護(hù)等多種藥理作用[18-20]。非瑟酮具有對(duì)抗不同病理過程的作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降糖、神經(jīng)保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[21-22]。鞣花酸作為一種天然多酚類生物活性物質(zhì)，具有清除自由基、抗腫瘤、抗炎、抗病毒效能等多種藥理作用[23-24]。異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種顯著的藥理活性[25]，其抗炎和細(xì)胞保護(hù)活性較強(qiáng)，現(xiàn)已開發(fā)出保護(hù)消化道黏膜的胃腸道用藥，對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制作用，并對(duì)化療藥物有減毒效果[26]。國外研究顯示表兒茶素能明顯減緩氧化，預(yù)防癌癥，減輕炎癥，延遲或治療人和動(dòng)物中由衰老和神經(jīng)引起等相關(guān)病癥[27-28]。蕓香苷具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗肥胖、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、血管保護(hù)及心臟保護(hù)等多種藥理學(xué)活性，在消化系統(tǒng)疾病的炎癥過程中具有明顯的調(diào)節(jié)作用[29-30]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)神經(jīng)、肝臟和心肌、防治糖尿病和骨質(zhì)疏松等藥理活性[31-33]，已在臨床上用于治療胃癌及心腦血管疾病[34]?？吕锢┚哂锌鼓[瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖溶、降血壓、抑制病毒、抗菌、抗炎等廣泛的藥理活性[35-36]。因此推測葉下珠治療結(jié)腸腫瘤、腺癌、前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、肝腫瘤和乳腺癌及炎癥的機(jī)制可能與TNF、AKT1、PTGS2和MMP9靶點(diǎn)有關(guān)，治療心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化和腦缺血的機(jī)制可能與靶點(diǎn)TNF、CASP3有關(guān)。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對(duì)葉下珠中的多組分、多靶點(diǎn)及疾病之間的關(guān)系和作用機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的預(yù)測分析，通過對(duì)所篩選出的以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、鞣花酸、柯里拉京為代表的10個(gè)關(guān)鍵化合物進(jìn)行了靶點(diǎn)、疾病及信號(hào)通路分析，與所檢索文獻(xiàn)[11-14, 37]針對(duì)葉下珠近年來藥理學(xué)研究分析結(jié)果所顯示葉下珠具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗血栓等主要藥理作用較為一致，且表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、鞣花酸、表兒茶素和柯里拉京均為多酚類成分，也是近年來對(duì)葉下珠化學(xué)成分分析研究的特征性成分。除此之外，本研究具有的一些特色體現(xiàn)在構(gòu)建了其關(guān)鍵核心靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)核心化合物及信號(hào)通路和疾病的多層次網(wǎng)絡(luò)模型圖，并結(jié)合當(dāng)前相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果進(jìn)行印證，為進(jìn)一步明確葉下珠的藥理作用機(jī)制提供了研究參考。

本研究結(jié)論尚存在一定的局限性，由于各數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)和文本挖掘獲取化合物及靶點(diǎn)數(shù)量有限，且槲皮素、蕓香苷及山柰酚在自然界植物中大量存在，靶點(diǎn)、信號(hào)通路及疾病數(shù)據(jù)存在對(duì)這幾種物質(zhì)篩選有一定的傾向性，采用相應(yīng)分析軟件的分析算法僅評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)相互關(guān)系，未考慮各候選成分含量、化合物間相互作用及藥物體內(nèi)代謝過程等因素，預(yù)測結(jié)果可能存在偏差，還需進(jìn)一步體內(nèi)體外的藥理和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。