閩產(chǎn)細(xì)葉石仙桃顯微鑒別及總氨基酸含量測(cè)定

于虹敏，陳小霞，洪 旖，盧澤雨，范世明，溫秀萍，林 羽

(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

細(xì)葉石仙桃是蘭科石仙桃屬植物細(xì)葉石仙桃PholidotacantonensisRolfe.的假鱗莖或全草，生于林中或蔭蔽處的巖石上，主產(chǎn)于浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東和廣西[1]。為民間常用的中草藥，具有清熱潤(rùn)燥、化痰止咳、滋陰解毒、涼血止痛等功效[2]。細(xì)葉石仙桃常作為石斛偽品使用，僅《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄，尚未被《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)收錄，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有性狀鑒別。細(xì)葉石仙桃作為閩南地區(qū)藥食兩用的藥材，深受人們喜愛[3]。植物作為人類重要的食物來源，也是我們?nèi)祟惈@取總氨基酸的主要途徑之一[4]，人類對(duì)氨基酸類物質(zhì)的需求在不斷的上升。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料可知，細(xì)葉石仙桃含有黃酮類、氨基酸類等多種化學(xué)成分，其研究主要集中于化學(xué)成分和藥理作用方面，缺乏對(duì)其藥用全草的生藥學(xué)鑒別；有關(guān)于部分蘭科植物總氨基酸含量測(cè)定的研究，如石斛、芳香石豆蘭等[5]，但未見關(guān)于石仙桃中總氨基酸含量測(cè)定研究。福建省石仙桃屬植物僅有石仙桃和細(xì)葉石仙桃2種，現(xiàn)對(duì)細(xì)葉石仙桃進(jìn)行顯微鑒別，并初步檢測(cè)其總氨基酸含量，以期為細(xì)葉石仙桃的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與試藥

紫外可見分光光度計(jì)UV9000(上海元析儀器有限公司)，生物顯微鏡(OLYMPUS CX31，奧林巴斯(中國)有限公司)；實(shí)地調(diào)查采集8批(福建省順昌縣2批次、屏南縣2批次、永春縣2批次、武夷山市2批次)細(xì)葉石仙桃樣品(以全草鮮品為采收標(biāo)準(zhǔn))，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為蘭科植物細(xì)葉石仙桃PholidotacantoniensisRolfe的全草；甘氨酸(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140624-201506)；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取順昌縣全株鮮品，除去雜質(zhì)，洗凈，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。選取新鮮細(xì)葉石仙桃的根、根莖、假鱗莖、葉等組織部位進(jìn)行徒手切片及表面制片；另取部分鮮品，用開水燙后，置于105 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎，過20目篩，置于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取少量樣品粉末，放置于載玻片上，經(jīng)過水合氯醛加熱透化或不經(jīng)透化，制作粉末制片。將所有制片置于數(shù)碼一體顯微鏡下觀察、拍攝，采用圖像處理軟件記錄顯微特征，進(jìn)行文字描述并繪畫。

2.1.1 根橫切面顯微特征 呈類圓形，直徑750～967 μm，根被細(xì)胞2～4 層，類圓形，壁稍厚，老根根被常脫離皮層；外皮層為一列細(xì)胞，類五邊形或六邊形，長(zhǎng)11～25 μm，寬20～37 μm，細(xì)胞壁呈馬蹄形增厚，厚約 3.3 μm；皮層3～4層，薄壁細(xì)胞大小懸殊，靠近外皮層和內(nèi)皮層處的一列細(xì)胞較小，類圓形至類橢圓形，大小約 15 μm，胞內(nèi)含較多草酸鈣簇晶，大小3.5～5 μm，其余皮層細(xì)胞大小約 40 μm，在靠近內(nèi)皮層處可見具紋孔薄壁細(xì)胞；內(nèi)皮層為一列類五邊形或六邊形細(xì)胞，長(zhǎng)10～22 μm，寬 15～31 μm，細(xì)胞壁極度增厚，胞腔極小且偏外側(cè)；中柱占整體的1/2，中柱內(nèi)木質(zhì)部束與韌皮部束相間排列呈放射狀，韌皮部束約 11 個(gè)，周圍有1～3 層纖維束包圍，木質(zhì)部束常對(duì)應(yīng)內(nèi)皮層的一個(gè)薄壁通道細(xì)胞；髓部不明顯，細(xì)胞類圓形，壁稍厚。見圖 1。

注：1.根被；2.外皮層；3.皮層；4.通道細(xì)胞；5.內(nèi)皮層；6.木質(zhì)部；7.韌皮纖維；8.韌皮部；9.髓部。

2.1.2 根狀莖橫切面顯微特征 呈類圓形，皮層多處破碎，細(xì)胞不規(guī)則形，壁稍增厚，胞內(nèi)偶見草酸鈣針晶和簇晶，內(nèi)外皮層細(xì)胞不明顯；中柱寬廣，基本組織為類圓形細(xì)胞，細(xì)胞間隙明顯，可見具紋孔細(xì)胞，大小 18～61 μm，胞內(nèi)偶見淀粉粒；中柱散有約110個(gè)外韌型維管束，維管束呈類圓形或橢圓形，大小48～207 μm，靠近外圍的維管束有時(shí)可見兩個(gè)連接成一個(gè)，木質(zhì)部相連，韌皮纖維相連。維管束在排列呈新月形或半圓形，纖維外側(cè)可見硅質(zhì)塊。見圖 2。

注：1.皮層；2.維管束；3.纖維及硅質(zhì)塊；4.中柱；5.韌皮部；6.木質(zhì)部。

2.1.3 假鱗莖橫切面顯微特征 形狀不規(guī)則，直徑0.9～1.4 cm，邊緣為深淺不一的波紋。表皮細(xì)胞一列，類長(zhǎng)方形，紅棕色，細(xì)胞壁增厚，外側(cè)壁厚約4 μm，無角質(zhì)層?；窘M織中，薄壁細(xì)胞類圓形或不規(guī)則形，不規(guī)則排列，大小懸殊，胞內(nèi)含淀粉粒，大小 5～10 μm，可見草酸鈣簇晶和針晶束，有樹脂道和具紋孔薄壁細(xì)胞；散在約65個(gè)外韌型維管束，大小50～267 μm，木質(zhì)部導(dǎo)管大小不一，韌皮部較小，韌皮部周圍有新月形纖維群包圍，1～8層纖維細(xì)胞組成，體積較大的維管束在纖維群外側(cè)常附著半圓形的硅質(zhì)塊，直徑約3.3 μm，并有1個(gè)明顯空腔，大小 32～130 μm。見圖 3。

注：1.表皮；2.薄壁細(xì)胞；3.木質(zhì)部；4.韌皮部；5.纖維束及硅質(zhì)塊。

2.1.4 葉橫切面顯微特征 等面葉，主脈稍凹陷，一對(duì)側(cè)脈凸出。上下表皮均被角質(zhì)層，厚約1.7 μm，均具1～2個(gè)非腺毛，為單細(xì)胞，向葉肉凹陷，不凸出表皮。上表皮細(xì)胞一列，下表皮細(xì)胞一列，類五邊形，長(zhǎng) 17～47 μm，寬23～41 μm，含氣孔約16個(gè)，由3～5個(gè)石細(xì)胞組成。葉肉組織分化不明顯，可見具紋孔細(xì)胞。葉綠體均勻分布，黏液細(xì)胞類圓形，內(nèi)含草酸鈣簇晶，大小約 3.5 μm，可見草酸鈣針晶束，偶見方晶，維管束外韌型，約21 個(gè)，主脈處維管束較小，側(cè)脈一對(duì)維管束最大，大維管束含環(huán)繞形纖維群，兩端6～8 層，纖維內(nèi)偶見晶體。見圖 4。

注：1.角質(zhì)層；2.上表皮；3.非腺毛；4.纖維束；5.木質(zhì)部；6.葉肉組織；7.韌皮部；8.下表皮；9.氣孔。

2.1.5 粉末顯微特征 全草粉末呈淺棕色。①氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞 3～5 個(gè)，長(zhǎng) 25～53 μm，寬 8～33 μm，也有平軸式氣孔；②石細(xì)胞紅棕色，長(zhǎng)約 50～75 μm，寬約 25～50 μm，壁極厚，胞腔極?。虎勰纠w維長(zhǎng)條形，直徑至 17 μm，長(zhǎng)150～208 μm，壁稍厚，木化，孔溝明顯；④散有較多淀粉粒，大小5～36 μm；⑤草酸鈣簇晶眾多，棱角尖銳，直徑 3～10 μm；⑥草酸鈣針晶成束或散在，束長(zhǎng)30～46 μm，針晶長(zhǎng)短懸殊，8～43 μm；⑦導(dǎo)管有螺紋導(dǎo)管、環(huán)紋導(dǎo)管以及偶見具緣紋孔導(dǎo)管，螺紋導(dǎo)管稍多，直徑約 17 μm，長(zhǎng)約 200 μm，具緣紋孔導(dǎo)管片段較小，寬約 17 μm，長(zhǎng)約 27 μm；⑧可見較多薄壁細(xì)胞碎片，為具紋孔薄壁細(xì)胞，類橢圓形，寬約 17 μm，長(zhǎng)50～70 μm，可見網(wǎng)狀紋理薄壁細(xì)胞，類圓形、類長(zhǎng)方形或不規(guī)則形，寬約 40 μm，長(zhǎng)約83 μm；⑨下表皮細(xì)胞碎片常見，寬 25～30 μm 長(zhǎng)60～67 μm，紋孔明顯；⑩可見較多纖維束，內(nèi)含類圓形硅質(zhì)塊，硅質(zhì)塊大小約 6～10 μm；非腺毛為單細(xì)胞，稍彎曲，長(zhǎng)約22 μm，寬約4 μm。見圖 5。

注：1.氣孔；2.石細(xì)胞；3.木纖維；4.淀粉粒；5.草酸鈣簇晶和方晶；6.針晶及針晶束；7.導(dǎo)管；8.薄壁細(xì)胞；9.表皮細(xì)胞；10.纖維及硅質(zhì)塊；11.非腺毛。

2.2 總氨基酸含量測(cè)定

有研究表明，蘭科植物中主要含有菲類、聯(lián)芐、甾體、黃酮類、多糖、氨基酸等成分[6]。目前對(duì)蘭科植物中總氨基酸含量測(cè)定的研究報(bào)道很少，采用溶劑加熱回流提取法提取總氨基酸，并參照《中國藥典》2020版中紫外可見分光光度法[7]，以甘氨酸為對(duì)照品、用茚三酮顯色法測(cè)定細(xì)葉石仙桃中的總氨基酸含量。

2.2.1 溶液的制備 準(zhǔn)確稱取甘氨酸對(duì)照品0.5 000 g，用蒸餾水至完全溶解并定容100 mL，得甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密移取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，得 0.05 mg/mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液；精密稱取茚三酮1.000 g，加入適量的無水乙醇至完全溶解后，定容至50 mL，得2%茚三酮溶液，冷藏備用；取一定量醋酸鈉加蒸餾水溶解，用冰醋酸溶液緩慢調(diào)節(jié)pH，加蒸餾水稀釋定容至100 mL，搖勻，即得醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6)標(biāo)記備用；準(zhǔn)確稱取細(xì)葉石仙桃樣品約1.5 g，置于圓底燒瓶中，加入85%的乙醇35 mL，于90 ℃水浴鍋中加熱回流60 min，將提取液抽濾，濾渣重復(fù)1次，合并濾液，將濾液移至100 mL容量瓶，用85%乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 mL，置于10 mL容量瓶中，隨行空白，再分別加入2%茚三酮溶液3.0 mL和醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH=6)2.0 mL，混勻，置于90 ℃水浴中加熱15 min，待冷卻至室溫，用蒸餾水定容，在190～900 nm區(qū)間掃描。結(jié)果表明：陰性空白溶液無干擾，說明顯色方法的專屬性良好，供試品與對(duì)照品溶液在568 nm 均有最大吸收，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為568 nm。

2.2.3 檢測(cè)條件的單因素考察 本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)顯色劑用量、緩沖溶液pH、緩沖液用量、水浴加熱溫度、水浴加熱時(shí)間進(jìn)行了檢測(cè)條件的考察。結(jié)果表明：最佳檢測(cè)條件為測(cè)定波長(zhǎng)568 nm、2%茚三酮溶液用量3.0 mL、緩沖液pH=6、緩沖液用量2.0 mL、水浴加熱溫度80 ℃、水浴加熱時(shí)間40 min。

2.2.4 提取工藝的單因素試驗(yàn)考察 本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)4個(gè)考察因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，已優(yōu)選出最佳提取條件為85%乙醇，35.0 mL乙醇，提取60 min，提取2次。

2.2.5 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取甘氨酸對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、12.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加水定容，按“2.2.2”項(xiàng)下操作方法，測(cè)定其吸光度值。以甘氨酸對(duì)照品溶液的濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A= 0.059C+ 0.083，R2= 0.999 1。

2.2.6 方法學(xué)考察 按文獻(xiàn)[4]、[5]方法和在本課題組前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)及加樣回收率試驗(yàn)，結(jié)果供試品溶液吸光度的RSD小于3%，表明儀器精密度、試驗(yàn)重復(fù)性良好；供試溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定；其加樣回收率為96.84%～101.21%。

2.2.7 含量的測(cè)定 取8批細(xì)葉石仙桃藥材，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和顯色后，分別測(cè)定吸光度，計(jì)算總氨基酸的含量。結(jié)果表明，8批藥材中的總氨基酸含量為4.290～6.310 mg/g，即為0.429%～0.631%?？紤]到不同地方收集的藥材樣品含量差異，以及實(shí)驗(yàn)操作過程中可能存在的誤差性，因此暫定閩產(chǎn)細(xì)葉石仙桃按干燥品計(jì)算，以甘氨酸(C2H5NO2)計(jì)其總氨基酸含量，不得少于0.4%。

3 討論

本文通過性狀和顯微鑒別，特征結(jié)果與趙秀貞[8]、張小佳等[9]的研究有所差異。細(xì)葉石仙桃顯微特征明顯，須根含較多簇晶，內(nèi)皮層通道細(xì)胞單個(gè)存在；根莖外韌型維管束 110 個(gè)，韌皮部一側(cè)具有新月形纖維束，纖維外側(cè)有硅質(zhì)塊；假鱗莖表皮細(xì)胞一列，壁全增厚，未見角質(zhì)層，基本組織細(xì)胞以紋孔狀紋理居多，有淀粉粒和簇晶，外韌型維管束65 個(gè)，韌皮部一側(cè)具纖維束，纖維外側(cè)具硅質(zhì)塊和空腔；尤其葉的維管束以主脈處較小，一對(duì)側(cè)脈明顯偏大，上下表皮均具有內(nèi)凹的非腺毛等特征，均可作為細(xì)葉石仙桃的鑒別特征。但其中假鱗莖整體橫切面整體性狀與原植物有所差異，初步推測(cè)因?yàn)槲醇皶r(shí)切片等原因造成。

參閱所查文獻(xiàn)可知，測(cè)定氨基酸的方法有很多種。在預(yù)實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)上，對(duì)比幾種測(cè)定方法，考慮到紫外分光光度法操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)成本低。故本文采用紫外分光光度法來初步測(cè)定不同產(chǎn)地細(xì)葉石仙桃中的總氨基酸。

研究結(jié)果明確了細(xì)葉石仙桃的基源及顯微特征，可作為其品種鑒定的重要依據(jù)。同時(shí)暫定了細(xì)葉石仙桃藥材中總氨基酸含量不得少于0.4%，可為細(xì)葉石仙桃的進(jìn)一步研究、質(zhì)量控制和資源開發(fā)利用提供參考。