二精方對Ⅱ型糖尿病氧化應(yīng)激作用實驗研究

趙 雨，褚海清，王結(jié)鑫，王淵學(xué)，梁 凱，張立明，2，3*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750004；3.回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetesmellitus，T2DM)是一類由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損引起的、導(dǎo)致全身代謝出現(xiàn)紊亂進(jìn)而長期損害人體多個器官的全身性代謝性疾病。氧化應(yīng)激與T2DM的發(fā)展緊密相關(guān)，T2DM的表現(xiàn)形式之一就是自由基和活性氧生成增加，有研究報道，當(dāng)機(jī)體受到刺激時，體內(nèi)會產(chǎn)生過量的氧自由基，自由基過多將會打破氧化與抗氧化之間的動態(tài)平衡，誘發(fā)氧化應(yīng)激，直接損傷細(xì)胞，減少胰島素分泌，進(jìn)而會促進(jìn)糖尿病癥狀加重及其多種并發(fā)癥的發(fā)生[2]，所以氧化應(yīng)激反應(yīng)在Ⅱ型糖尿病中發(fā)揮著重要作用。

二精方由枸杞、黃精組成，在《圣濟(jì)總錄》中早有記載，這兩味藥均是滋陰補(bǔ)腎藥，且均為藥食同源中藥，食物綠色無害，藥物防治疾病，食物和藥物一樣可以用于治愈患者[3-4]，因此枸杞-黃精具有很好的開發(fā)價值。研究表明，枸杞具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心血管、抗氧化、保護(hù)眼睛、預(yù)防糖尿病等作用[5-6]，黃精具有抗氧化、降低血糖、降低血脂、調(diào)節(jié)免疫力、強(qiáng)心、抗炎、抑菌、抗腫瘤等功效[7]，兩者對于糖尿病都有一定的防治作用。本實驗所用二精方提取液是由枸杞-黃精按1∶1組合，經(jīng)提取濃縮制得。本課題通過研究二精方提取液對機(jī)體氧化應(yīng)激各項指標(biāo)的影響來探討二精方對Ⅱ型糖尿病模型大鼠的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買60只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗室。實驗動物合格證號：SCXY(寧)2015-0001。

1.2 藥物及試劑

二精方提取液制備：按枸杞-黃精(1∶1)的比例稱取飲片，75%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并2次濾液并濃縮。鹽酸二甲雙胍片(規(guī)格0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：AAU9951)。

鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，100 mg/瓶，CAS NO：18883-66-4)：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)試劑盒，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 動物模型制備與實驗分組[8]

60只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只，隨機(jī)選取1組作為空白對照組行普通飼料喂養(yǎng)，其余5組50只高糖高脂飼料誘導(dǎo)8周后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg造模，空白對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，期間禁食不禁水12 h；1天后，再次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，空白對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，期間禁食不禁水12 h。腹腔注射7天后尾部取血用血糖儀測血糖，以血糖水平大于 11.1 mol/L，并伴有多尿癥狀的大鼠作為成模大鼠進(jìn)行實驗。造模成功后將成模大鼠分為模型組、二甲雙胍組、二精方提取液高劑量組、中劑量組、低劑量組。模型組、空白對照組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，二精方提取液高劑量組給予1.7 g/(kg·d)灌胃，中劑量組給予3.4 g/(kg·d)灌胃，低劑量給予6.8 g/(kg·d)灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍250 mg/(kg·d)灌胃，造模成功后進(jìn)行藥物干預(yù)，每天1次，共30天。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般狀態(tài) 每天觀察大鼠1次，查看其有無毛色、活動和精神狀況異常，每周稱量并記錄1次大鼠體質(zhì)量，監(jiān)測其體質(zhì)量增長情況。

2.2.2 MDA、SOD、GSH-Px、CAT、HK、PK水平 造模及給藥結(jié)束后，麻醉后處死大鼠，于各組大鼠股動脈取血，將取得的血液實驗室溫度中靜置20 min，3 000 r/min高速離心10 min，取血清置于EP管中，置于-80 ℃冰箱中備用，采用酶聯(lián)免疫吸附法對丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)指標(biāo)進(jìn)行檢測。并摘取各組大鼠肝臟，沖洗凈血液，快速分離肝臟組織，置于凍存管內(nèi)于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，按相關(guān)試劑盒具體操作說明測定肝臟中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀態(tài)比較

除空白對照組外，各組大鼠在喂養(yǎng)高糖高脂飼料期間，體質(zhì)量與初始質(zhì)量相比較均有所增加。造模成功后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，且體質(zhì)量下降明顯。而空白對照組一般狀況良好，進(jìn)食、飲水量、尿量均正常。

給藥后，與模型組相比，二精方提取液低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠的一般狀況有所好轉(zhuǎn)，多飲、多食、多尿現(xiàn)象癥狀減輕，體質(zhì)量下降趨勢也有所減慢。與空白對照組相比，癥狀仍較明顯。

3.2 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較[9]

與空白對照組相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.01)；SOD活性水平顯著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、二精方提取液高、中、低劑量組MDA含量均有極顯著性的降低(P<0.01)。SOD活力水平：相比較于模型組，陽性組、二精方提取液中和高劑量有顯著性提高，低劑量組無顯著性提高(P>0.05)。GSH-Px活力水平：相比較于模型組，陽性組、高劑量組有顯著性提高，中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見圖1、圖2。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 各組大鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px水平比較

與空白對照相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.01)；SOD活性水平顯著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組、二精方提取液高、中劑量組MDA含量均有極顯著性的降低(P<0.01)，低劑量組大鼠MDA含量降低，但無顯著性差異(P>0.05)。SOD活力水平：相比較于模型組，二甲雙胍組、二精方提取液高、中、低劑量組均有極顯著性提高。GSH-Px活力水平：相比較于模型組，二甲雙胍組、二精方提取液高、中、低劑量組均有極顯著性提高(P<0.01)。結(jié)果見圖3、圖4。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各組大鼠肝臟CAT、HK、PK水平比較

與空白對照組相比，模型組CAT、HK、PK活力水平極顯著下降(P<0.01)。其中CAT活力和HK活力：與模型組相比，陽性組、二精方提取液高、中、低劑量組有極顯著性提高(P<0.01)；PK活力：二精方提取液中、高劑量組相比于模型組有顯著性提高，低劑量組比模型組有提高，但是無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見圖5。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

2017年版《中國Ⅱ型糖尿病防治指南》顯示，隨著人們生活、飲食習(xí)慣的改變，糖分?jǐn)z取不斷增多，我國Ⅱ型糖尿病發(fā)病趨勢日趨年輕化，發(fā)病率也逐漸升高。有研究證實，糖尿病患者發(fā)病過程中伴隨著明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]，據(jù)此，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高患者抗氧化能力可以成為我們研究T2DM的重點方向。氧化應(yīng)激是指高活性反應(yīng)分子ROS在體內(nèi)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致體內(nèi)自由基、活性氧等物質(zhì)過多堆積，機(jī)體氧化和抗氧化作用之間的動態(tài)平衡被打破，進(jìn)而引起組織損傷的一種異常生理狀態(tài)[11]。通常情況下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)疾病產(chǎn)生時，這種平衡被打破，機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，引起氧化應(yīng)激造成組織器官損傷。糖尿病的一種表現(xiàn)形式就是自由基和高活性反應(yīng)分子ROS增多，氧化與抗氧化失衡，ROS活性分子直接氧化和損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類等。這些現(xiàn)象都表明糖尿病與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[12]。

二精方是經(jīng)典古方，又名二精丸，《奇效良方卷之二十一·諸虛門》中記載：“常服助氣益精，補(bǔ)填丹田，活血駐顏，長生不老。”現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，二精方具有很好的降糖降脂、改善記憶作用。白素芬等[13]發(fā)現(xiàn)二精丸多糖可顯著降低糖尿病大鼠血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)含量，對糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀有所緩解。劉海霞等[14]研究表明，枸杞子水提物有助于防治與氧化應(yīng)激相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥。因此本實驗聚焦氧化應(yīng)激，通過構(gòu)建糖尿病大鼠模型探討二精方中有效成分與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)之間的作用關(guān)系與機(jī)制。

本實驗結(jié)果中，與模型組相比，二精方提取液組MDA含量都有所降低，SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK活力水平均有一定程度的提高。其中二精方提取液高、中劑量組血清MDA、SOD，肝臟MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK與模型組比較都有極顯著差異(P<0.01)。低劑量組對各組大鼠血清MDA、SOD、GSP-Px的影響都不甚明顯(P>0.05)。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量升高能間接表明體內(nèi)氧自由基增多，氧化程度加深。隨著自由基的增多，脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，生物膜隨之受損，最終導(dǎo)致組織損傷。而GSP-Px作為一種清除酶，能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的過氧化物和脂質(zhì)過氧化物清除，減輕對組織的損傷。SOD是一種清除O2-的金屬酶，其活性能夠反映抗氧化能力。己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)在糖酵解過程中起著重要作用，是葡萄糖分解過程中關(guān)鍵限速酶，其活性的增強(qiáng)能加快糖降解，起到降低血糖的作用。過氧化氫酶(CAT)是一種酶類清除劑，可促進(jìn)過氧化氫分解，從而保護(hù)抗氧化系統(tǒng)。因此可以通過MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK來反映機(jī)體的氧化程度和抗氧化的能力。此外，與空白組相比，模型組大鼠肝臟大鼠血清MDA顯著提高，SOD、GSH-Px活性水平顯著下降，CAT、HK、PK活力水平極顯著下降(P<0.01)，這表明糖尿病大鼠模型自由基損傷程度加重，抗氧化能力下降，清除率降低，ROS增多對組織的損傷加重，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[15]。

綜上所述，二精方提取液可改善T2DM模型大鼠的血糖水平，增強(qiáng)抗氧化活性和清除自由基能力，保護(hù)ROS增多引起的組織損傷，有助于防止與氧化應(yīng)激相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥，并加快糖酵解，起到降低血糖和防治糖尿病的作用。