蘇木乙酸乙酯提取物對野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈壓、血漿BNP及肺小動脈的影響

常艷賓，李 雁，張麗麗，鄭佳新

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

肺動脈高壓是一類以肺血管阻力進行性升高為主要特征，發(fā)病率、致死率及病死率都很高的心肺疾病。肺動脈高壓的核心病理生理改變是持續(xù)性肺血管收縮、血管重構(gòu)、原位血栓形成和血管周炎性浸潤等，導(dǎo)致肺小動脈狹窄、肺循環(huán)阻力增加、右心負荷增大，最終導(dǎo)致右心功能衰竭和死亡[1-3]。目前，內(nèi)皮素受體拮抗劑和前列環(huán)素類兩種靶向藥物給肺動脈高壓患者的治療帶來了希望，二者代表藥物如波生坦、萬他維可在一定程度上降低肺動脈壓，但由于費用昂貴，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。因此，在肺動脈高壓的治療上仍需開發(fā)新型藥物。既往研究表明，蘇木乙酸乙酯提取物有免疫抑制、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抑制心肌細胞凋亡、增強心肌收縮力、穩(wěn)定斑塊等作用[4-8]，可保護心肌組織，但其對肺動脈高壓是否具有防治作用還不明確。故本課題組通過觀察蘇木乙酸乙酯提取物對野百合堿致肺動脈高壓大鼠肺動脈壓、血漿腦尿鈉肽(BNP)及肺血管重塑的影響，探討了蘇木乙酸乙酯提取物對肺動脈高壓是否具有保護作用。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠，體重(200±10)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證編號：2014001XYXK。實驗動物飼養(yǎng)按1989年衛(wèi)生部發(fā)布的《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》執(zhí)行，在通風、溫度及濕度適宜的環(huán)境下自由攝食、飲水。

1.2實驗藥物 蘇木乙酸乙酯提取物由黑龍江中醫(yī)藥大學制劑室制備提供，將蘇木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纖維素鈉溶液，配制成濃度為73.6 mg/mL(低濃度)和147.2 mg/mL(高濃度)的藥液，現(xiàn)用現(xiàn)配。阿魏酸鈉購于黑龍江省哈爾濱博潤生物公司(純度為97%)，將阿魏酸鈉粉末9 g溶于300 mL羧基纖維素鈉溶液中，配制成濃度為30 mg/mL的溶液。

1.3主要試劑及儀器 野百合堿(C240l-600mg,Sigma公司)；蘇木精-尹紅染色液(北京，biosharp公司)，大鼠血漿BNP試劑盒(黑龍江省哈爾濱博潤生物公司，批號：R-D140305)，美國RT-雷杜酶標儀(6100型，USA)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Q5100W病理圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA)。

1.4實驗方法 采用完全隨機化的分組方法將50只雄性SD大鼠分為空白組、模型組、蘇木乙酸乙酯高劑量組、蘇木乙酸乙酯低劑量組、阿魏酸鈉組，每組10只。實驗開始第1天，空白組腹腔注射生理鹽水10 mL/kg；其余組大鼠參考文獻[9]方法建立肺動脈高壓模型：一次性腹腔注射1%的野百合堿溶液60 mg/kg(用2∶8的無水乙醇和生理鹽水混合液配成，6 mL/kg，14～21 d即形成肺動脈高壓)；第15天開始，空白組和模型組給予羧甲基纖維素鈉溶液10 mL/(kg·d)灌胃,蘇木乙酸乙酯高、低劑量組分別給予蘇木乙酸乙酯提取物溶液1 472 mg/(kg·d)[生藥量2.3 g/(kg·d)]、736 mg/(kg·d)[生藥量1.15 g/(kg·d)]灌胃,阿魏酸鈉組給予阿魏酸鈉0.3 g/(kg·d)灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃至實驗第28天。

1.5觀察指標及方法

1.5.1各組大鼠一般情況 實驗過程中觀察各組大鼠的精神、活動、飲食、體重、死亡等情況。

1.5.2平均肺動脈壓(mPAP) 參照劉文利[10]法測定mPAP：術(shù)前12 h大鼠均禁食，自由飲水,給予20%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射后，將大鼠固定于手術(shù)板上，切開頸正中皮膚，分離出右靜脈。將聚乙烯塑料軟管充滿肝素鈉，一端連接右側(cè)頸內(nèi)靜脈，依次插入右房、右室，到達肺動脈；另一端與壓力換能器連接，并與心電監(jiān)護系統(tǒng)相連，待壓力波形穩(wěn)定后，依據(jù)導(dǎo)管位置及監(jiān)視器所示的壓力波形圖，依次實時記錄肺動脈壓，然后取其均值作為每只大鼠的mPAP。

1.5.3血漿BNP水平 完成肺動脈壓測定后，用真空冷卻抗凝試管從頸靜脈中抽取血液，于低溫離心機3 500 r/min離心(離心半徑13.5 cm)后，分離血漿，應(yīng)用ELISA法測定各組大鼠血漿BNP水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.4肺組織HE染色病理觀察 將各組大鼠肺臟固定于10%中性福爾馬林緩沖液中，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色、封片，光學顯微鏡下觀察肺小動脈形態(tài)學改變，對終末細支氣管伴行的肺小動脈管壁厚度運用圖像分析系統(tǒng)進行分析，測量各標本肺小動脈管壁厚度、血管直徑,每張切片均測量3～4個肺小動脈，取其平均值，計算管壁面積、血管面積，然后計算管壁厚度與血管外徑百分比、管壁面積與血管面積百分比，評估管壁增厚程度及管腔狹窄程度。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 空白組大鼠呼吸平穩(wěn)，活潑好動，皮毛光亮，體重逐漸增加；造模各組大鼠腹腔注射MCT 7 d后活動減少，倦臥，食量減少，第14天開始出現(xiàn)皮毛枯槁、蜷縮，活動逐漸減少，出現(xiàn)喘息，體重增加明顯減慢；模型組大鼠第21天出現(xiàn)鼻部及唇周發(fā)紺，開始有大鼠出現(xiàn)死亡；阿魏酸鈉組、蘇木乙酸乙酯高劑量組、蘇木乙酸乙酯低劑量組大鼠實驗20 d后精神狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，活動量逐漸增多，毛發(fā)較前光整，呼吸喘息減輕，食量及體重開始增加,蘇木乙酸乙酯低劑量組和阿魏酸鈉組好于蘇木乙酸乙酯高劑量組，尤以蘇木乙酸乙酯低劑量組改善明顯。實驗第28天，空白組大鼠均存活，模型組有5只存活，蘇木乙酸乙酯高劑量組和阿魏酸鈉組均有8只存活，蘇木乙酸乙酯低劑量組有9只存活。其中模型組和阿魏酸鈉組各有2只大鼠、蘇木乙酸乙酯高劑量組有1只大鼠有不同程度的胸水和/或腹水。

2.2各組大鼠肺動脈壓及血漿BNP水平比較 造模各組大鼠mPAP、血漿BNP水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；蘇木乙酸乙酯高劑量組、蘇木乙酸乙酯低劑量組和阿魏酸鈉組大鼠mPAP、血漿BNP水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，蘇木乙酸乙酯低劑量組與阿魏酸鈉組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),但均明顯低于蘇木乙酸乙酯高劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和肺動脈高壓各組大鼠平均肺動脈壓及血漿BNP水平比較

2.3各組大鼠肺組織及肺血管病理形態(tài)學表現(xiàn) 光學顯微鏡下觀察：空白組大鼠肺動脈壁清晰，小動脈管壁內(nèi)皮細胞扁平連續(xù)，厚薄較為一致，血管周圍無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺泡出現(xiàn)少量漿液性滲出，局部有炎性細胞浸潤，肺小動脈壁增生，尤以平滑肌層增生顯著，管腔變窄，血管內(nèi)皮細胞變成不規(guī)則形狀，血管內(nèi)皮粗糙，血管內(nèi)有漿液性滲出，并伴有充血，支氣管腔內(nèi)有少量漿液性滲出；阿魏酸鈉組大鼠肺泡內(nèi)出現(xiàn)大面積的漿液性滲出，滲出物呈現(xiàn)淡粉色，其中混有少量的紅細胞以及脫落的肺泡上皮細胞，局部伴有炎性細胞浸潤，肺小動脈擴張充血，小動脈壁厚度與模型組相比明顯變薄，但與空白組相比增厚明顯；蘇木乙酸乙酯高、低劑量組大鼠肺小動脈壁厚度差異不大，但厚于空白組而薄于模型組和阿魏酸鈉組。見圖1。

圖1 空白組和肺動脈高壓各組大鼠肺血管病理切片HE染色表現(xiàn)(×100)

2.4各組大鼠肺小動脈管壁厚度及管腔狹窄程度比較 造模各組大鼠肺小動脈管壁厚度/血管直徑、管壁面積/血管面積均明顯高于空白組(P均<0.05)，蘇木乙酸乙酯高劑量組、蘇木乙酸乙酯低劑量組和阿魏酸鈉組大鼠均明顯低于模型組(P均<0.05)，且蘇木乙酸乙酯高劑量組和蘇木乙酸乙酯低劑量組均明顯低于阿魏酸鈉組(P均<0.05)，蘇木乙酸乙酯高劑量組和蘇木乙酸乙酯低劑量組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和肺動脈高壓各組大鼠肺小動脈管壁厚度及管腔狹窄程度比較

3 討 論

肺動脈高壓的主要病理生理改變?yōu)榉窝芙Y(jié)構(gòu)重塑，病理學特征主要表現(xiàn)為肺動脈內(nèi)膜增生、中膜肥厚及特征性叢樣病變。其中免疫炎癥因素在動脈型肺動脈高壓形成及血管重塑過程中起著關(guān)鍵作用，病理觀察顯示重構(gòu)的肺動脈周圍炎癥細胞浸潤明顯，包括肥大細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞及樹突狀細胞[11-12]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡及支氣管腔內(nèi)有少量漿液性滲出，局部有炎性細胞浸潤，肺小動脈平滑肌層增生顯著，管腔變窄，血管內(nèi)有漿液性滲出，并伴有充血，說明野百合堿造模誘發(fā)肺動脈高壓后導(dǎo)致大鼠肺血管重塑，產(chǎn)生免疫炎癥。蘇木乙酸乙酯提取物高、低劑量組大鼠肺泡漿液性滲出較少，局部炎性細胞浸潤、肺小動脈壁增生及管腔變窄程度較模型組輕，說明蘇木乙酸乙酯提取物可有效逆轉(zhuǎn)肺血管的重塑及抑制炎性滲出。

BNP與心力衰竭、急性冠脈綜合征、肺源性心臟病等心血管疾病關(guān)系密切。BNP的釋放與肺動脈高壓程度呈正相關(guān)，BNP水平可以較為準確地評估機體肺動脈高壓的程度及肺血管重塑情況[13-14]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠mPAP及血漿BNP水平均明顯高壓空白組，而BNP水平與右心功能關(guān)系密切，說明模型大鼠存在右心功能明顯下降。與模型組比較，蘇木乙酸乙酯提取物高、低劑量組大鼠mPAP及血漿BNP水平均有不同程度的降低，說明蘇木乙酸乙酯提取物可降低肺動脈壓力、右室容量及壓力負荷，減少BNP的合成和分泌，避免BNP的生物學作用，改善心室功能。

綜上所述，蘇木乙酸乙酯提取物可通過逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠的肺血管重塑及降低血漿BNP水平，達到降低肺動脈壓力及改善心功能的目的，但其具體的作用機制尚不明確，還需進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。