體外氧糖剝奪培養(yǎng)條件促進人牙髓細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究

李莉芬， 朱亞琴， 江龍

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔綜合科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞蛋白質(zhì)合成加工的主要場所，多種因素如氧化應(yīng)激、鈣離子紊亂、細菌感染等刺激下均可影響細胞蛋白質(zhì)的合成，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過減少蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶以及相關(guān)蛋白表達上調(diào)，促進錯誤折疊蛋白質(zhì)降解等途徑恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，以上變化統(tǒng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endo?plasmic reticulum stress，ERS）［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用是促進蛋白質(zhì)降解以期恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體內(nèi)平衡。然而，如果沒有實現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體內(nèi)平衡，當(dāng)細胞內(nèi)的錯構(gòu)蛋白質(zhì)超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理極限時，促凋亡因子C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，chop）［2］和caspase?12 等［3］介導(dǎo)的細胞凋亡途徑就會被激活，引起細胞的死亡。缺血條件下，細胞生命活動所依賴的糖和氧氣不足，易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這在多項研究中得到了證實。體外氧糖剝離（oxygen?glucose deprivation，OGD）是目前國際上比較公認的體外模擬細胞缺血的手段［4］，研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可調(diào)節(jié)OGD 導(dǎo)致的人SH?SY5Y 細胞的死亡［5］、小鼠骨細胞死亡［6］，并參與腎臟缺血再灌注損傷［7］。牙髓由于其特殊的解剖結(jié)構(gòu)，被低讓性的硬組織所包繞，缺乏有效的側(cè)枝循環(huán)，因此在受到外界刺激如外傷、充填操作以及局部藥物應(yīng)用等情況下，易發(fā)生缺血現(xiàn)象［8?9］。目前對缺血條件下牙髓生物學(xué)行為了解并不多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與調(diào)控缺血條件下牙髓細胞的生命活動尚不清楚。因此，本研究通過無血清DMEM 加上低氧（2%O2）建立人牙髓細胞（human dental pulp cells，hD?PCs）OGD 模型來模擬牙髓細胞缺血［10?12］，檢測其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化情況及調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑和儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，美國）；0.25%胰蛋白酶（Gibico，美國）；噻唑藍［3?（4，5?dimethyl?2?thiazolyl）?2，5?diphenyl?2H?tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β?甘油磷酸鈉、Trizol 總RNA 提取試劑（Sigma，美國）；地塞米松（Sigma，美國），維生素C（Sigma，美國）；BCIP/NBT 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天，上海）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR 試劑盒（Takara，日本）；兔抗鼠磷酸化RNA 依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（phospho?PKR like ER kinase，p?perk）抗體（1∶1 000稀釋）、兔抗鼠磷酸化活化真核起始因子2α（phospho?eukaryotic initiation factor，p?eIF2α）抗體（1∶1 000 稀釋）、鼠抗人β?actin 抗體（1∶5 000 稀釋）（Cell Signaling，美國），鼠抗人基質(zhì)細胞抗原?1（stromal cell antigen?1，STRO?1）抗體（1∶1 000 稀釋）（Abcam，美國）；酶標儀（Infinite，Tecan，瑞士）；流式細胞儀（Attune NxT，BD，美國）；倒置顯微鏡（IX70，奧林巴斯，日本）。

1.2 hDPCs 的培養(yǎng)與鑒定

本實驗已經(jīng)獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會的批準（審批號：SH9H?2020?T305?1）。取14～28 歲健康個體因治療需要拔除的健康恒牙，用無菌PBS 沖洗。利用滅菌的高速渦輪開髓，取出牙髓組織，并用組織剪把牙髓組織剪成約1.0 mm3大小的組織塊，均勻鋪在培養(yǎng)皿底部，表覆細胞培養(yǎng)專用玻片，加入20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。每72 h 換1 次培養(yǎng)液，待細胞長滿后進行傳代培養(yǎng)。

取第三代長勢良好的細胞融合至70%～80%時，更換礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)（含有10 mmol/L β 甘油磷酸鈉、50 μg/L 維生素C 和0.1 μmol/L 地塞米松的DMEM 培養(yǎng)液），培養(yǎng)7 d 后取出，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定10 min 后進行ALP 染色。收集第2 代細胞制備單細胞懸液，PBS 洗滌后離心，重懸獲得細胞懸液后裝入EP 管中，加入STRO?1 抗體避光孵育30 min 后，離心5 min 后去上清加入PBS 重懸，使用流式細胞儀進行檢測。

1.3 OGD 模型建立及hDPCs 形態(tài)觀察、活性檢測

取第三代牙髓細胞生長至80%～90%時，進行OGD 處理。OGD 處理前一天撤掉血清，將無糖培養(yǎng)基放入低氧培養(yǎng)箱（2%O2）中30 min，同時棄掉細胞原有的高糖培養(yǎng)基，更換為無糖培養(yǎng)基，進行低氧培養(yǎng)（作為OGD 培養(yǎng)條件），常規(guī)培養(yǎng)的細胞作為對照。

OGD 培養(yǎng)0、2、4、8 h 時，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

在96 孔板中將hDPCs 以每孔5 × 104個接種（每孔100 μL），常規(guī)培養(yǎng)孵育24 h，去除上清，每孔加入100 μL 無糖DMEM 培養(yǎng)液后置于2%O2培養(yǎng)。所有組別均設(shè)5 個復(fù)孔。分別培養(yǎng)0、2、4、8 h后，每孔加入20 μL MTT 溶液置于培養(yǎng)箱避光孵育4 h 后棄上清液，加入DMSO 終止反應(yīng)。常溫充分震蕩10 min 后，酶標儀選定490 nm 波長檢測每孔吸光度值。

1.4 qRT?PCR

將OGD 培養(yǎng)4 h 的hDPCs 取出，加入Trizol 獲取細胞總RNA。每個樣品的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以SYBGreen 為探針進行熒光定量PCR 反應(yīng)，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因剪切型X 盒結(jié)合蛋白1（spliced X?box binding protein 1，sXBP1）、激活轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、chop mRNA 表達。以管家基因GAPDH 作為對照，具體引物序列參照文獻［13］詳見表1。

表1 qRT?PCR 引物序列［13］Table 1 Sequences of the qRT?PCR primers［13］

1.5 Western blot 檢測

取OGD 培養(yǎng)4 h 的hDPCs，用預(yù)冷PBS 沖洗細胞3 次，加入RIPA 裂解液冰上裂解收取上清液。用BCA 法檢測細胞樣本總蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜膜上，脫脂奶粉封閉2 h 后，加入p?perk、p?eIF2α、β?actin 抗體，4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，洗膜后電化學(xué)發(fā)光顯色拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS18.0 軟件包對數(shù)據(jù)進行t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 hDPCs 的體外培養(yǎng)

原代培養(yǎng)1 周左右，倒置顯微鏡中可見散在的牙髓細胞從各個組織塊邊緣爬出，呈梭形，形態(tài)類似于成纖維細胞；常規(guī)傳代后，貼壁生長于整個培養(yǎng)皿底部（圖1a、1b）；流式細胞儀檢測到牙髓細胞STRO?1 抗體表達陽性（圖1c）；礦化誘導(dǎo)7 d 后，細胞ALP 染色呈陽性（圖1d）；以上結(jié)果符合文獻對于hDPCs 特性的報道［14］。

Figure 1 Culture of hDPCs in vitro圖1 人牙髓細胞的體外培養(yǎng)及鑒定

2.2 OGD 培養(yǎng)對hDPCs 細胞形態(tài)、活性的影響

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞呈梭形，胞體飽滿，細胞連接緊密（圖2a）；OGD 處理2 h 后細胞排列較稀疏，胞體變腫脹，可見少量死細胞（圖2b），OGD 處理4 h 后，細胞排列更加稀疏，細胞完整性遭到嚴重破壞，胞膜破裂，可見大量懸浮死細胞（圖2c）；OGD 處理8 h 后細胞大量死亡，基本無細胞結(jié)構(gòu)（圖2d）。

Figure 2 Morphological changes in hDPCs after different OGD culture times圖2 氧糖剝奪不同時間下牙髓細胞形態(tài)變化

MTT 實驗結(jié)果顯示，與未經(jīng)OGD 處理的細胞相比，隨著OGD 處理時間增加，hDPCs 吸光度值逐漸下降，細胞存活率下降，2 h、4 h、8 h 組與對照組（0 h）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。由于OGD 處理時間過長，細胞大部分發(fā)生死亡，因此將之后的OGD 處理時間設(shè)為4 h。

Figure 3 Detection of survival rate of hDPCs after different OGD culture times圖3 氧糖剝奪不同時間hDPCs 細胞存活率檢測

2.3 qRT?PCR 結(jié)果

與常規(guī)培養(yǎng)細胞相比，OGD 培養(yǎng)4 h 后，hDPCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子mRNA 表達明顯增加：sXBP1（t＝7.441）、ATF4（t＝6.953）、chop（t＝7.989）的mRNA相對表達明顯上調(diào)（P＜0.05）（圖4）。

Figure 4 mRNA expression of endoplasmic reticulum stress markers detected by qRT?PCR 4 h after OGD culture圖4 qRT?PCR 檢測OGD 培養(yǎng)4 h 后hDPCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵信號分子mRNA 表達

2.4 Western blot 結(jié)果

OGD 處理4 h 后，hDPCs p?perk（t＝13.681）和p?eIF2α（t＝42.907）蛋白水平增加（P＜0.05）（圖5）。

Figure 5 Western blot for protein expression of ERS makers 4 h after OGD culture圖5 Western blot 檢測OGD 培養(yǎng)4 h 后hDPCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵信號分子蛋白表達

3 討 論

牙髓作為結(jié)締組織，含有神經(jīng)和血管，但由于其僅通過根尖孔與外界相通，因此在發(fā)生組織炎癥、外傷、局部物理或化學(xué)藥物刺激時很容易出現(xiàn)血供減少的現(xiàn)象。血供減少將導(dǎo)致細胞氧氣和葡萄糖供應(yīng)不足，限制了細胞能量產(chǎn)生所需的基本物質(zhì)，造成細胞處于低能量狀態(tài)，擾亂細胞正?；顒樱罱K導(dǎo)致細胞的死亡［15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則是細胞面對此類刺激產(chǎn)生的反應(yīng)。細胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少未折疊或錯構(gòu)蛋白的堆積使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)節(jié)細胞的生命活動［16］，為了證實在缺血缺氧條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了調(diào)控牙髓細胞的生命活動。本研究首先在體外建立了OGD 模型，模擬細胞的體外缺血［4，10］。本研究實驗結(jié)果顯示，OGD 處理的hPDCs，胞體腫脹變圓，排列疏松，漂浮的死細胞增多；較正常培養(yǎng)的細胞存活率下降，并呈現(xiàn)出明顯的時間趨勢。

同時，本研究從mRNA 和蛋白水平兩方面比較了OGD 處理和正常培養(yǎng)的hPDCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的變化。perk、ER 跨膜蛋白肌醇酶1（inositol?re?quiring enzyme type 1，IRE1）和ATF6 這3 個跨膜蛋白是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動因子［17?19］。細胞受到刺激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路啟動，可以激活各種轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)下游目的基因的表達，磷酸化的IRE1 能夠誘發(fā)sXBP1 的mRNA 剪切成具有高度轉(zhuǎn)錄活性的sXBP1［20］。同時perk 蛋白的激活能夠增加eIF2α 的磷酸化從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4 的活化［21］。如果細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活動持續(xù)發(fā)生而無法被緩解，則會進一步會激活信號通路的下游因子chop［2］的表達，從而調(diào)控細胞的凋亡。在本研究中，OGD 誘導(dǎo)的牙髓細胞ATF4、chop 和sXBP1 分子的mRNA 表達明顯升高；同時，磷酸化perk 和eIF2α蛋白的表達明顯增加。這些結(jié)果提示，hPDCs在OGD 條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上調(diào)。

綜上所述，hPDCs 在OGD 條件下細胞活性下降，并伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活動增強。在其他組織細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以保護細胞，而持續(xù)嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活動則可以導(dǎo)致細胞死亡，同時會引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴張，并觀察到細胞胞漿出現(xiàn)大量空泡［22］。在機體腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過誘導(dǎo)cas?pase12 激活［23］，引起一系列的級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細胞的凋亡，從而加重機體細胞的損傷，然而hPDCs 在OGD 條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控機制還不清楚。需要進一步的研究來闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與牙髓缺血的關(guān)系，為牙髓病治療提供新的策略和方向。

【Author contributions】Li LF designed the study, peformed the ex?periments，analyzed the data，and wrote the article. Zhu YQ，Jiang L revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.