幾種農用抗生素誘導植物對灰霉病的抗性及其 信號轉導途徑研究

安 康，韓 興，劉海濤，王 嬌，李亞寧，劉大群,

（1.河北農業(yè)大學 植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治技術創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心，河北 保定 071001；2. 中國農業(yè)科學院 研究生院，北京 100081）

農用抗生素是微生物發(fā)酵產生的次級代謝產物，能有效抑制或殺滅農作物病原物以及調節(jié)作物生長發(fā)育［1］。農用抗生素種類繁多、分布廣泛，主要來自真菌、細菌、放線菌以及其他微生物［2］，與傳統(tǒng)化學農藥相比具有毒性低、易降解等特點，在農作物病蟲害綜合防控中起到重要作用，其防治作用機理包括破壞病原物的細胞結構，抑制病原菌物質能量代謝以及提高植物抗病性等［3］。探明農用抗生素防治植物病害的作用機制，是合理、有效使用這些藥劑進行病蟲害防控的重要前提。以往的研究中更多只關注農用抗生素對病原菌的直接殺滅作用，隨著植物免疫學的迅速發(fā)展，農用抗生素對植物本身抗病性的誘導作用也越來越受到研究者們的關注。胡能［4］發(fā)現(xiàn)水稻經15 mg/L 農抗702 誘導處理后，可提高植株內防御酶活性，促進抗病相關蛋白的表達，增強水稻對紋枯病、白葉枯病的抗病性。王志坤［5］發(fā)現(xiàn)使用12.5 mg/L 武夷菌素處理盆栽茶樹，可以促進其葉綠素可溶性糖含量的增長，誘導茶樹體內丙二醛含量的下降及抗病相關酶活性的增強。Shimizu 等［6］從杜鵑花中分離到的R-5 菌株能產生放線菌類與多烯類抗生素，可誘導植物產生抗病性。

申嗪霉素是銅綠假單胞桿菌M18 菌株代謝產生的一類26 位大環(huán)內酯類抗生素［7］，其作用機制是在病原菌發(fā)生還原反應的生理過程中產生O2-、H2O2、氧化谷胱甘肽和轉鐵蛋白，破壞細胞正常代謝，從而抑制病原菌的生長［8］。錢艷杰等［9］發(fā)現(xiàn)水稻分蘗期施用申嗪霉素，可促進水稻根系生長以及提高作物產量。朱祥［7］發(fā)現(xiàn)申嗪霉素與水楊酸復配后，誘導植物產生抗病性要顯著高于單獨藥劑誘導的處理。多抗霉素是金色鏈霉菌分泌的一類肽嘧啶核苷酸抗生素，其對病菌的殺滅作用主要是抑制病原菌細胞壁幾丁質合成，抑制病原菌芽管和菌絲體局部擴展，從而導致病原菌死亡［10］。春雷霉素是春日鏈霉菌分泌的一類氨基糖苷類抗生素，可通過干擾病原菌的代謝，破壞蛋白質的生物合成，抑制菌絲生長，使病原菌喪失侵染和繁殖能力［11］。

本實驗室前期選取生產上常用的一些農用抗生素，通過溫室試驗和離體葉片接種試驗檢測這些農用抗生素誘導煙草對灰霉病的抗性，篩選出申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素這3 種對植物灰霉病誘抗效果較好的抗生素，檢測發(fā)現(xiàn)其分別在40 mg/L 4 d、5 mg/L 4 d、80 mg/L 3 d 處理條件下對灰霉病的誘抗效果較好。在此前期研究的基礎上，本研究進一步檢測了這3 種農用抗生素對不同植物灰霉病的誘導抗病性效果，同時對其誘抗煙草灰霉病的信號轉導途徑相關基因表達量的變化進行了檢測和分析，為拓展這些農用抗生素的使用范圍及豐富其防治作用機理提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：95%申嗪霉素(Shenzinomycin）原藥來自上海交通大學生命科學技術學院，70%多抗霉素(Polyoxin）原藥來自上海源葉生物科技有限公司，73%春雷霉素(Kasugamycin）原藥來自石家莊深泰化工有限公司。

供試植物：本氏煙、茄子、番茄、辣椒、黃瓜、草莓。

供試菌株：灰霉病菌（Botrytis cinerea）菌株由河北農業(yè)大學植物病害生物防治實驗室保存。

1.2 農用抗生素誘導植物對灰霉病抗性的效果檢測

將濃度為40 mg/L 申嗪霉素、5 mg/L 多抗霉素、80 mg/L 春雷霉素分別噴霧處理煙草、草莓、黃瓜、番茄、辣椒、茄子植株的下部葉片。因原藥不易溶于水，配置抗生素溶液時先用1 mL 甲醇溶解，再加水稀釋至相應濃度。為避免噴霧處理時對上部葉片的影響，操作時使用塑料袋將上部葉片包裹好。每個處理重復10 次，每棵苗取1 片葉。3 種抗生素分別在處理后的第4 天、第4 天、第3 天，取上部未處理的葉片，置于水瓊脂培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中放1 片葉，將直徑為0.7 cm 的灰霉病菌菌塊接種于葉片左側（注：其中番茄葉片較小，所以番茄葉片接種直徑為0.5 cm 的菌餅），右側接種PDA 培養(yǎng)基塊為對照。21 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并記錄病斑大小，計算病斑減小率。

1.3 抗病信號轉導途徑相關基因表達量的檢測

選取10 ～12 葉期的煙草，按照1.2 方法進行噴霧處理，分別于施藥后的24 、48 、72 、96 、120 、144 和168 h，用消毒的剪刀剪下處理葉與系統(tǒng)葉（注：下部噴霧處理的葉片為處理葉，上部未處理的葉片為系統(tǒng)葉）稱重，用錫箔紙包好后迅速置于液氮中冷卻，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ看渭粝绿幚砣~與系統(tǒng)葉的一部分，保證上述7 個時間點采取的為同一葉片。

1.3.1 RNA 的提取 煙草葉片RNA 的提取采用全式金生物技術有限公司TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒。

1.3.2 cDNA 的合成 采用全式金生物技術有限公司TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒。

1.3.3 熒光定量qPCR 檢測信號轉導途徑相關基因的表達量 抗病信號轉導途徑相關基因及內參基因的引物序列參考Alizadeh［12］和Shoresh［13］，具體見表1。

表1 抗病信號轉導途徑相關基因及內參基因引物Table 1 Primers of genes related to disease resistance signal transduction pathway and the internal reference gene

以反轉錄的cDNA 為模板，使用全式金生物技術有限公司的qPCR mix，在伯樂BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR 儀中對NPR1、CTR1、ETR1這3 個抗病相關基因的表達量進行檢測分析。根據(jù)儀器檢測到的CT 值，按照公式2-△△CT，計算所測基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 農用抗生素誘導的不同植物對灰霉病的抗性

2.1.1 申嗪霉素誘導的植物抗病性 如圖1 所示，利用40 mg/L 申嗪霉素誘導煙草、茄子、草莓、番茄、辣椒、黃瓜對灰霉病的抗性，處理后的6 種植物葉片上的灰霉病病斑直徑均顯著低于甲醇對照（P＜0.05），病斑減小率從高到低依次為煙草（55.56%）＞番茄（47.18%）＞黃瓜（45.41%）＞茄子（38.71%）＞草莓（35.62%）＞辣椒（25.85%），表明申嗪霉素能夠誘導這6 種植物對灰霉病產生抗性。

圖1 申嗪霉素誘導不同植物對灰霉病的抗性Fig.1 Resistance of different plants against tobacco gray mold after induced by shenzinomycin

2.1.2 多抗霉素誘導的植物抗病性 如圖2 所示，利用5 mg/L 多抗霉素誘導煙草、茄子、草莓、番茄、辣椒、黃瓜對灰霉病菌的抗病性，處理后的6 種植物葉片上的灰霉病病斑直徑均顯著低于甲醇對照（P＜0.05），病斑減小率從高到低依次為番茄（46.48%）＞黃瓜（45.41%）＞茄子（41.29%）＞草莓（39.73%）＞煙草（37.57%）＞辣椒（25.17%）。表明多抗霉素能夠誘導這6 種植物對灰霉病產生抗性。

圖2 多抗霉素誘導不同植物對灰霉病的抗性Fig.2 Resistance of different plants against tobacco gray mold after induced by polyoxin

2.1.3 春雷霉素誘導的植物抗病性 結果如圖3 所示，利用80 mg/L 春雷霉素誘導煙草、茄子、草莓、番茄、辣椒、黃瓜對灰霉病菌的抗病性，處理后的6 種植物葉片上灰霉病的病斑直徑均顯著低于甲醇對照（P＜0.05），病斑減小率從高到低依次為番茄（51.26%）＞黃瓜（39.51%）＞煙草（34.07%）＞茄子（32.59%）＞草莓（23.47%）＞辣椒（20.17%），表明春雷霉素能夠誘導這6 種植物對灰霉病產生 抗性。

圖3 春雷霉素誘導不同植物對灰霉病的抗性Fig.3 Resistance of different plants against tobacco gray mold after induced by kasugamycin

2.2 抗病信號轉導途徑相關基因表達量的變化

2.2.1NPR1基因表達量的變化NPR1基因是植物抗病信號轉導途徑的關鍵基因［14-15］，是調節(jié)SA 和JA/ET 信號轉導途徑的重要調控因子。如圖4 所示，處理葉中，申嗪霉素處理在120 h、多抗霉素處理在72 h、春雷霉素處理在96 h 時，NPR1基因表達量最高，顯著高于清水對照，分別為對照的9.82 倍、5.02 倍、4.13 倍，隨后NPR1基因表達量有所下降，但依然顯著高于清水對照。系統(tǒng)葉中，NPR1基因表達量呈現(xiàn)出相似的趨勢，但存在一定的滯后性，申嗪霉素處理在120 h、多抗霉素處理在96 h、春雷霉素處理在120 h 時NPR1基因表達量最高，分別為清水對照的11.48 倍、3.36 倍、4.10 倍，隨后NPR1基因表達量開始下降，但仍顯著高于清水對照。表明申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素均可激發(fā)煙草植株系統(tǒng)抗病過程中NPR1標志基因的表達，從而激活SA 和JA/ET 信號轉導途徑，誘導植株產生系統(tǒng)抗病性。

2.2.2CTR1基因表達量的變化CTR1基因位于乙烯（ET）受體下游，是ET 信號通路中關鍵的負調控因子。如圖5 所示，處理葉中，申嗪霉素處理、多抗霉素處理、春雷霉素處理均在120 h 時，CTR1基因表達量最低，清水對照分別為三者的2.27 倍、5 倍、20 倍。系統(tǒng)葉中，CTR1基因表達量呈現(xiàn)出類似的趨勢，但存在一定的滯后性，申嗪霉素和春雷霉素在96 h 之后，多抗霉素在72 h 之后，CTR1基因表達量開始低于對照，表達量最低時，清水對照分別為三者的1.61 倍、2.04 倍、2.44 倍，其中多抗霉素在144 h 之后CTR1基因表達量又趨于正常水平。表明申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素可抑制ET下游負調控基因CTR1的表達，從而誘導植株產生系統(tǒng)抗病性。

圖5 申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素誘導后煙草CTR1 基因表達量的變化Fig.5 Changes in CTR1 gene expression in tobacco after induced by shenzinomycin, polyoxin and kasugamycin

2.2.3ETR1基因表達量的變化ETR1基因是乙烯（ET）信號通路中關鍵的負調控因子。如圖6 所示，處理葉中，申嗪霉素處理在120 h、多抗霉素處理在48 h、春雷霉素處理在120 h 時，ETR1基因表達量最低，清水對照分別為三者的4 倍、2.13 倍、1.69 倍。系統(tǒng)葉中，ETR1基因表達量呈現(xiàn)出類似的趨勢，但存在一定的滯后性，申嗪霉素處理在120 h、多抗霉素處理在96 h、春雷霉素處理在144 h 時，ETR1基因表達量最低，清水對照分別為三者的2.08 倍、3.36倍、2.08 倍。表明申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素可抑制ETR1基因在ET 信號轉導通路中的表達，從而誘導植株產生系統(tǒng)抗病性。

圖6 申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素誘導后煙草ETR1 基因表達量的變化Fig.6 Changes in ETR1 gene expression in tobacco after induced by shenzinomycin, polyoxin and kasugamycin

3 討論與結論

本研究通過對申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素這3 種農用抗生素誘導煙草、草莓、黃瓜、番茄、辣椒、茄子等不同植物灰霉病抗性試驗，發(fā)現(xiàn)這3 種抗生素處理后葉片的病斑面積均顯著低于對照，表明它們可以誘導不同植物產生對灰霉病的抗性，為拓展這些抗生素的使用范圍及其合理有效利用，以及豐富農用抗生素的防治作用機理提供了重要依據(jù)。

抗病信號通過復雜的信號轉導途徑促進或刺激植物潛在防御基因的表達，是植物誘導抗性分子機制的關鍵之一。目前研究比較深入的信號轉導途徑有水楊酸途徑（SA）、茉莉酸途徑（JA）與乙烯途徑（ET）［16-18］。NPR1是SA 信號通路關鍵基因，可以調節(jié)PR1、PR5等多個抗病相關基因的表達，誘導植物獲得抗病性，是SA 和JA/ET 信號通路的協(xié)同交叉過程中的一個關鍵調控基因［19］。張薇等［20］報道煙草經蛋白激發(fā)子PeaT1 處理后，其體內SA含量增加，與誘導抗性相關的PR1a、PR1b、NPR1基因均顯著上調。JA/ET 是植物誘導系統(tǒng)獲得抗病性（SAR）的第2 信使［21］，CTR1基因是ET 轉導途徑中下游的負調控因子［22］。SA 和JA/ET 信號轉導途徑是一個錯綜復雜的網狀結構，既相互獨立又相互聯(lián)系。彭金英等［23］報道番茄植株被昆蟲取食后，可以激活植物體內SA 和JA/ET 信號轉導通路，誘導植物產生抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/L 申嗪霉素、5 mg/L 多抗霉素、80 mg/L 春雷霉素誘導處理植物后，均能抑制煙草體內ETR1和CTR1基因的表達，促進NPR1抗病基因表達，從而誘導植株產生抗病性。另外，系統(tǒng)葉中的基因表達量相對于處理葉存在一定的滯后性。因此推測申嗪霉素、多抗霉素、春雷霉素的誘導處理，激活了煙草SA 信號通路與JA/ET 信號通路，從而誘導植株產生抗病性。