小麥TaPR1 基因啟動(dòng)子的克隆及啟動(dòng)活性分析

王麗珊，王 珅，王 菲，王海燕，劉大群

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035）

PR1 是 病 程 相 關(guān)（Pathogenesis related，PR）蛋白家族成員，具有抗真菌、抗病毒功能，幫助植物抵抗逆境脅迫，同時(shí)也是病原物誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性 抗 性（Systemic acquire resistance，SAR）防 御信號(hào)獲得的標(biāo)志。劉玉晴等［1］在研究植物激素對(duì)水稻OsPR1A 表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯處理后的水稻幼苗在接種水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzae，Xoo）后6 d，OsPR1A 大量表達(dá)，病斑生長(zhǎng)受到明顯抑制；Van 等［2］發(fā)現(xiàn)擬南芥中編碼PR1蛋白的22 個(gè)基因中，只有1 個(gè)PR1基因在受到細(xì)菌及激素誘導(dǎo)時(shí)提高表達(dá)；符曉等［3］發(fā)現(xiàn)大薯中6個(gè)DaPR1基因在炭疽菌侵染時(shí)表達(dá)量均顯著提升。

本課題組前期利用Southern 雜交試驗(yàn)驗(yàn)證了TaPR1在小麥基因組中包含4 個(gè)拷貝，利用‘中國(guó)春’缺體- 四體系明確該基因定位于7D 染色 體［4］；Gao［5］發(fā)現(xiàn)當(dāng)受到信號(hào)分子脫落酸（Abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)12 h 時(shí)，TaPR1基因出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量是0 h 的3.1 倍；水楊酸（Salicylic acid，SA）誘導(dǎo)后72 h，TaPR1基因出現(xiàn)表達(dá)高峰，是0 h 的5.4 倍。栗小英［6-7］發(fā)現(xiàn)TaPR1基因在葉銹菌侵染小麥12 h 后出現(xiàn)第1 個(gè)表達(dá)高峰，第2 個(gè)表達(dá)高峰出現(xiàn)在120 h，該基因在根、莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在小麥葉片中的表達(dá)量，在小麥抗葉銹病近等基因系TcLr35 中，TaPR1的表達(dá)量隨著植株生長(zhǎng)而增加。張家瑞［8］利用基因槍將亞細(xì)胞定位重組體pCamA-TaLr35PR1-GFP 轉(zhuǎn)化進(jìn)入洋蔥表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TaPR1 蛋白定位在細(xì)胞外，且利用酵母系統(tǒng)驗(yàn)證TaPR1基因所攜帶的信號(hào)肽具有分泌活性。申松松等［9］利用GST-Pull down 及酵母雙雜交技術(shù)篩選到谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase）、細(xì)胞色素b6（Cytochrome b6）、應(yīng)激蛋白（Stress protein）等小麥中與TaPR1 互作的蛋白。王菲等［10］利用VIGS 及體外抑菌試驗(yàn)證明TaPR1 能夠有效抑制葉銹菌的生長(zhǎng)，且TaPR1 能夠通過(guò)與TaTLP1 的互作增強(qiáng)小麥抗葉銹病的能力。

前期已經(jīng)明確TaPR1基因參與小麥抗葉銹病防御反應(yīng)，然而對(duì)于調(diào)控TaPR1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子了解甚少。因此，本研究擬通過(guò)克隆小麥TaPR1基因上游啟動(dòng)子序列，對(duì)其所包含的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，利用β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）組 織 化 學(xué) 染 色、綠 色熒 光 蛋 白（Green fluorescent protein，GFP）驗(yàn) 證 2 200 bp、900 bp 及290 bp 3 種不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列啟動(dòng)活性，以期明確具有較強(qiáng)啟動(dòng)活性的區(qū)域用于后續(xù)試驗(yàn)，為進(jìn)一步解析TaPR1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為小麥抗葉銹病近等基因系材料TcLr19， 本 氏 煙； 植 物 表 達(dá) 載 體 為pBI121 和pCamA，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治和分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，GUS 染色試劑盒購(gòu)自華越洋生物（北京）科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)所需引物

本試驗(yàn)所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 用于啟動(dòng)子克隆與啟動(dòng)活性分析的特異性引物Table 1 Primers for promoter cloning and activation activity analysis

1.3 pTaPR1 的克隆及序列分析

本研究前期已經(jīng)明確TaPR1基因定位于7D 染色體［4］，根據(jù)‘中國(guó)春’小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index）信息，獲得位于7D 染色體上TaPR1基因上游2 200 bp 序列，利用primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R。 以TcLr19 DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，連接載體pMD19-T 測(cè)序后序列比對(duì)，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式元件的預(yù)測(cè)。根據(jù)PlantCARE 預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合前期研究［5］中TaPR1對(duì)ABA 及SA 的特異性響應(yīng)，針對(duì)ABA 信號(hào)通路響應(yīng)元件ABRE 以及SA 信號(hào)通路響應(yīng)元件As-1，對(duì)pTaPR1進(jìn)行5′端分段缺失。

1.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

參考無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書完成啟動(dòng)活性驗(yàn)證 載 體pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290、pCamA-pTaPR12200、pCamApTaPR1900及pCamA-pTaPR1290的構(gòu)建。利用凍融法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，PCR 方法鑒定陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆，利用含有利福平（50 μg/mL）及卡那霉素（50 μg/mL）的LBman 震蕩培 養(yǎng)15 h，3 000 r/min 離 心15 min，重 懸 沉 淀 至OD600=0.8，注射本氏煙，避光培養(yǎng)48 h。

1.5 GUS 染色

設(shè)置未攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照攜帶pBI121 空載體。48 h 后取煙草葉片進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色，利用打孔器對(duì)葉片取樣，按照說(shuō)明書配置GUS 染色工作液，將樣品浸泡于GUS 染色液中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱，染色期間全程避光。20 h 后利用75%酒精對(duì)樣品進(jìn)行脫色處理，至葉片葉綠素完全褪去，此時(shí)陰性對(duì)照呈白色，觀察試驗(yàn)組葉片染色情況。

1.6 熒光觀察

設(shè)置pCamA 空載體為陽(yáng)性對(duì)照，未攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101 為陰性對(duì)照。48 h 后利用熒光顯微鏡觀察煙草葉片中GFP 熒光表達(dá)情況。剪取適量被侵染煙草葉片制作玻片，利用尼康Ti2-U 倒置熒光顯微鏡對(duì)煙草葉片下表皮進(jìn)行熒光觀察，波長(zhǎng)選擇490 nm，曝光時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為600 ms，拍照記錄細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTaPR1 的克隆

利用引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R進(jìn) 行 擴(kuò) 增 后，獲 得1 條 約2 300 bp 的 擴(kuò) 增 條 帶（見(jiàn)圖1），與預(yù)期大小一致，成功構(gòu)建重組載體T-pTaPR1，測(cè)序分析結(jié)果表明，序列中包括擴(kuò)增用特異性引物T-pro-TaPR1-F2200和T-pro-TaPR1-R，全長(zhǎng)共2 323 bp。BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段3′端113 bp 與TaPR1基因ORF 區(qū)5′端113 bp 相似性為100%，證明克隆得到的2 200 bp 位于TaPR1基因上游5′端，暫命名為pTaPR1，將此序列確定為后續(xù)研究目標(biāo)。

圖1 pTaPR1 擴(kuò)增結(jié)果Fig .1 Amplification results of pTaPR1

2.2 pTaPR1 順式作用元件分析

利用PlantCARE 對(duì)序列進(jìn)行順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)TaPR1基因上游啟動(dòng)子序列中包含啟動(dòng)子核心元件TATA-box、CAAT-box，還含有能夠其他功能響應(yīng)元件，如-1 960 bp、-1 482 bp、-436 bp、-284 bp 位置上響應(yīng)SA 的AS-1 作用元件， -2 008 bp 位 置 上AACCTAA 序 列 的MYB 轉(zhuǎn) 錄 因子結(jié)合位點(diǎn)MRE，-2 200 bp 位置的WRKY 轉(zhuǎn)錄因 子 結(jié) 合 位 點(diǎn)W-box，-840 bp、-593 bp、-630 bp、-434 bp 位 置 的4 個(gè)ABA 響 應(yīng) 元 件ABRE， -443 bp 的低溫響應(yīng)元件LTR，3 個(gè)無(wú)氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE 分別在-1 816 bp、-1 347 bp、-867 bp，參與胚乳特異性表達(dá)的AACA_motif 作用元件在-220 bp，-164 bp 位置上游調(diào)控分生組織特異性表達(dá)元件CAT-box 等（見(jiàn)圖2）。

圖2 pTaPR1 順式作用元件預(yù)測(cè)Fig . 2 Prediction of cis-acting elements in pTaPR1

2.3 pTaPR1 啟動(dòng)活性檢測(cè)

2.3.1pTaPR1的分段 根據(jù)PlantCARE 預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合前期研究［5］中TaPR1對(duì)植物激素ABA 及SA的特異性響應(yīng)，針對(duì)元件ABRE 以及AS-1 的位置對(duì)pTaPR1進(jìn)行5′端缺失分段，將pTaPR1分為pTaPR12200、pTaPR1900及pTaPR12903 種不同區(qū)段。利用無(wú)縫克隆構(gòu)建重組載體，電泳結(jié)果表明，各體系擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為2 200、900 和290 bp（見(jiàn)圖3），與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建重 組 載 體pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290、pCamA-pTaPR12200、pCamApTaPR1900及pCamA-pTaPR1290，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 重組載體菌液PCR 驗(yàn)證Fig. 3 PCR products of recombined vectors

2.3.2 GUS 活性檢測(cè) 將重組載體pBI121-pTaPR12200、pBI121-pTaPR1900、pBI121-pTaPR1290分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射煙草，GUS染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照（未攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101）酒精脫色后葉片呈白色，表明煙草葉片中無(wú)GUS基因本底表達(dá)；攜帶質(zhì)粒pBI121 的農(nóng)桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，該組煙草葉片呈藍(lán)色，表明GUS基因在35S 啟動(dòng)子的啟動(dòng)下，在煙草葉片中正常表達(dá)；攜帶重組載體pBI121-pTaPR12200和pBI121-pTaPR1900的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，脫色后的葉片顯藍(lán)色，證明2 200 bp 和900 bp 的pTaPR1具有啟動(dòng)活性（見(jiàn)圖4）；攜帶重組載體pBI121-pTaPR1290的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，脫色后葉片顯白色，證明290 bppTaPR1無(wú)法啟動(dòng)下游GUS基因表達(dá)。

圖4 pTaPR1 驅(qū)動(dòng)GUS 基因的表達(dá)驗(yàn)證Fig. 4 Validation of the expression of GUS gene driven by pTaPR1

2.3.3 GFP 熒光觀察 將重組載體pCamA-pTaPR12200、pCamA-pTaPR1900、pCamA-pTaPR1290分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，注射煙草，GFP 熒光觀察結(jié)果顯示，陰性對(duì)照（未攜帶質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101）葉片在熒光場(chǎng)下無(wú)可見(jiàn)綠葉熒光，表明煙草葉片中GFP基因無(wú)本底表達(dá)；攜帶質(zhì)粒pCamA 農(nóng)桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，葉片在熒光場(chǎng)可觀察到綠色熒光，細(xì)胞核及細(xì)胞輪廓清晰可見(jiàn)，表明GFP基因在35S 啟動(dòng)子的啟動(dòng)下，在煙草葉片中正常表達(dá)；當(dāng)農(nóng)桿菌攜帶重組載體pCamApTaPR12200和pCamA-pTaPR1900侵染煙草葉片，熒光場(chǎng)中可觀察到綠色熒光，GFP基因正常表達(dá)，pTaPR12200和pTaPR1900具有啟動(dòng)活性；當(dāng)農(nóng)桿菌攜帶重組載體pCamA-pTaPR1290侵染煙草葉片，無(wú)法觀察到綠色熒光，290 bppTaPR1不能激活GFP基因表達(dá)，pTaPR1290無(wú)啟動(dòng)活性（見(jiàn)圖5）。

圖5 煙草葉片的GFP 熒光觀察Fig. 5 GFP fluorescence observation of tobacco

3 討論與結(jié)論

5′端缺失分段是尋找啟動(dòng)子啟動(dòng)活性關(guān)鍵區(qū)段的有效方法。董向向等［11］克隆獲得草莓開(kāi)花控制基因ARF4基因啟動(dòng)子，在順式作用元件預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行缺失分段，利用GUS染色分析啟動(dòng)子表達(dá)的特異性，確定生長(zhǎng)素和赤霉素是影響ARF4基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的因素；石翠翠等［12］利用啟動(dòng)子分段克隆的方法，尋找擬南芥AtRPK1啟動(dòng)子啟動(dòng)關(guān)鍵區(qū)域，利用5′端缺失的方法得到不同長(zhǎng)度的片段，分別構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入擬南芥驗(yàn)證啟動(dòng)活性，發(fā)現(xiàn)809 bp 啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因在各組織中均有表達(dá)，具有較高啟動(dòng)表達(dá)的能力；柴春月等［13］研究發(fā)現(xiàn)GmDRRP基因表達(dá)受激素的抑制，克隆上游1 500 bp 啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域包含多個(gè)已知逆境響應(yīng)相關(guān)的順式元件，啟動(dòng)活性驗(yàn)證試驗(yàn)表明擬南芥接種疫霉菌0.5 hGmDRRP啟動(dòng)子快速相應(yīng)誘導(dǎo)，2 h 后報(bào)告基因表達(dá)量顯著上升，222 bp 片段對(duì)疫霉的誘導(dǎo)響應(yīng)能力是全長(zhǎng)啟動(dòng)子的34%；楊少華等［14］研究發(fā)現(xiàn)甘薯IbMYB1基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)域位于 -2 183 ～-1 000 bp 區(qū) 段； 李 靜［15］發(fā) 現(xiàn) 大 豆GmCBL6基因啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域位于-969 ～-769 bp區(qū)段。本試驗(yàn)為驗(yàn)證TaPR1基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性的具體功能區(qū)域，利用GUS 染色及GFP 熒光觀察 對(duì)pTaPR12200、pTaPR1900和pTaPR1290進(jìn) 行 啟 動(dòng)活性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有pTaPR12200和pTaPR1900能夠驅(qū)動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)，表明TaPR1基因啟動(dòng)子活性的主要功能區(qū)域位于-2 200 ～-290 bp 區(qū)段。

啟動(dòng)子在上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中含有特殊的順式調(diào)控元件，這些調(diào)控元件通常可通過(guò)與某些特定的刺激信號(hào)分子結(jié)合，從而賦予啟動(dòng)子特定的調(diào)控和表達(dá)方式。順式作用元件As-1 在基因響應(yīng)SA 誘導(dǎo)時(shí)發(fā)揮重要作用，1989 年，Eric［16］發(fā)現(xiàn)As-1 元件是決定CaMV35S 啟動(dòng)子啟動(dòng)活性的關(guān)鍵區(qū)域；Qin 等［17］利用啟動(dòng)子區(qū)域點(diǎn)突變構(gòu)建GUS基因融合表達(dá)載體，通過(guò)驗(yàn)證不同激素誘導(dǎo)情況下轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)As-1 順式作用元件是35S 啟動(dòng)子響應(yīng)SA 誘導(dǎo)的關(guān)鍵元件。在目前確認(rèn)到的具有啟動(dòng)活性的pTaPR1 中，存在3 個(gè)SA 信號(hào)通路TGA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)As-1，猜測(cè)是該順式作用元件在調(diào)控TaPR1基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果將為后續(xù)解析TaPR1 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。