雞場銅綠假單胞菌外毒素A 基因遺傳變異分析

穆英麗，張 芳，解 佳，李玉榮，劉聚祥,3，王學靜,4，陳立功,3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071001；2.保定市動物疫病預防控制中心，河北 保定 071051； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疫病病原生物學華北科學觀測實驗站，河北 保定 071001；4.河北省畜牧獸醫(yī)研究所， 河北 保定 071000）

假單胞菌科、假單胞菌屬的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種革蘭氏陰性、條件致病菌［1］，廣泛分布于空氣、水、土壤中、健康人和動物的腸道和皮膚上，也易從尿道感染、燒傷、外傷、長期使用免疫抑制劑或放化療患者發(fā)現(xiàn)［2］。感染PA 的傷口可形成藍綠色膿液，故俗稱其為綠膿桿菌。PA 不僅可感染、損傷禽類、哺乳動物、爬行類和魚類的多種組織、器官［3］，還能致人的膿胸和燒傷患者的院內(nèi)感染［4-5］。PA 能產(chǎn)生外毒素A（Exotoxin A，ETA）、內(nèi)毒素、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等多種與毒力有關的物質(zhì)，其中ETA 是一種毒力很強的致死性外毒素，也是該菌最主要的致病因子［6］。ETA 是由toxA 基因編碼，成熟的ETA 分子是由613 個氨基酸組成的單鏈蛋白。Allured 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ETA 含3 個不同結(jié)構(gòu)功能區(qū)：氨基端由Ia(1-252 AA)和Ib(365- 404AA)組成的I 區(qū)，具受體識別功能，與靶細胞表面受體蛋白的結(jié)合有關；由253- 364 AA 組成的中央部分為II 區(qū)，與毒素跨膜轉(zhuǎn)運有關；羧基端由405-613 AA 組成的III 區(qū)，具ADP 核糖基轉(zhuǎn)移酶活性（ADP-ribosyltransferase，ADPRT）［8-9］，抑制靶細胞中的蛋白質(zhì)合成。近年來，有關雞PA 的報道逐漸增多［10-12］，但鮮見關于雞場銅綠假單胞菌毒力因子的研究報道。本研究在對PA分離鑒定的基礎上，分析了雞場PA 的ETA 蛋白基因變異情況，該結(jié)果可為PA 致病機理研究及其防控措施制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物材料

自2014 年1 月至2018 年2 月從河北省及周邊地區(qū)雞場采集水樣、雞鼻腔分泌物、氣囊、心臟、肝臟等病料。銅綠假單胞菌標準菌株（ATCC27853）為河北農(nóng)業(yè)大學張偉教授惠贈。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、十六烷三甲基溴化銨瓊脂（CA）、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP）均購自杭州天和微生物試劑有限公司。細菌基因組DNA 小量純化試劑盒（MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）、Tks GflexTM Polymerase 等試劑均購自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司。

1.3 細菌分離、鑒定

參照文獻［10］方法對采集的水樣及病料進行細菌分離培養(yǎng)。

1.4 16S rRNA 基因與ETA 蛋白基因的擴增及測序

根據(jù)銅綠假單胞菌16S rRNA 序列(GenBank 登錄號：HQ202541.1)和國際標準產(chǎn)毒菌PA103 株的ETA 基因序列(GenBank 登錄號：K01397.1)各設計1 對引物（見表1）。2 對引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR 相關引物Table 1 PCR related primers

參照細菌基因組DNA 小量純化試劑盒說明書進行PA 分離菌的基因組DNA 提取。16S rRNA 基因PCR 擴增體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、上下游引物各2 μL、dNTPs 4 μL、DNA 模板2 μL、Taq DNA 聚 合 酶 0.5 μL，dH2O 34.5 μL。PCR 程序：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性45 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。ETA 基因PCR 擴增體系為25 μL：2× Gflex PCR Buffer 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL、Tks Gflex DNA Polymerase 0.5 μL，加 入dH2O 至總體積為25 μL；PCR 擴增程序為：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s、68 ℃ 2 min，進行30 個循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，將PCR 陽性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向基因測序。

1.5 16S rRNA 基因與ETA 蛋白基因遺傳進化分析

PA 分離菌16S rRNA 基因測序結(jié)果經(jīng)拼接驗證，應用DNAStar 分析軟件對7 株PA 分離菌的16S rRNA 基因序列（基因登錄號分別為MZ707717.1、MZ707718.1、 MZ707719.1、 MZ707720.1、MZ707721.1、 OK298396.1、 OK298395.1）與10株PA 參考菌株（基因登錄號分別為AY905552.1、KF447771.1、EU081518.1、HM036358.1、HQ023428.1、KT869138.1、NR_113599.1、NR_114471.1、NR_117678.1、DQ864493.1）、1 株大腸桿菌（基因登錄號為AJ567540.1）、1 株沙門菌（基因登錄號AB188789.1）、1 株巴氏桿菌（基因登錄號AY078998.1）、1 株雞副嗜血桿菌（基因登錄號為GU737687.1）、1 株金黃色葡萄球菌（基因登錄號L37597.1）和1 株鏈球菌（基因登錄號LC613243.1）的16S rRNA 基因序列進行比較和同源性分析，用MEGA7 軟件繪制針對16S rRNA 基因序列的遺傳進化發(fā)生樹，并進行遺傳進化分析。

PA 分離菌ETA 基因測序結(jié)果經(jīng)拼接、驗證，截取成熟的ETA 結(jié)構(gòu)蛋白基因全長，應用DNAStar分析軟件對7 株PA 分離菌的ETA 基因序列及其推導的氨基酸序列與GenBank 中27 株PA 參考菌株相應序列進行比較和同源性分析；用MEGA7 軟件繪制針對ETA 基因序列的遺傳進化發(fā)生樹，分析PA ETA 基因遺傳變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離、鑒定結(jié)果

自2014 年1 月至2018 年2 月從河北省及周邊地區(qū)雞場水樣和病雞分離、純化7 株細菌分離物，根據(jù)培養(yǎng)特性、菌落特征初步判定為PA。經(jīng)PCR方法擴增7 株分離菌的16S rRNA 基因序列，電泳條帶與預期目的條帶大小相符（見圖1）。測序結(jié)果經(jīng)拼接、驗證得到7 株分離菌的16S rRNA 基因序列。序列分析結(jié)果表明，7 株分離菌之間的16S rRNA 基因序列同源性為99.9%～100.0%；7 株分離菌與10 株PA 參考菌株之間核苷酸序列同源性為99.4%～100.0%，與大腸桿菌、沙門菌、巴氏桿菌、雞副嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌之間核苷酸序列同源性僅為79.9%～86.4%。遺傳進化分析結(jié)果表明，7 株分離菌的16S rRNA 基因與10 株PA 參考菌株遺傳距離較近；與大腸桿菌、沙門菌、巴氏桿菌、雞副嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌遺傳距離均較遠（見圖2），因此，判定7 株分離菌均為PA。

圖1 銅綠假單胞菌16S rRNA 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 1 The electrophoresis result of PCR product of 16S rRNA gene of PA

圖2 銅綠假單胞菌16S rRNA 基因遺傳發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of PA

2.2 ETA 蛋白基因PCR 及測序結(jié)果

經(jīng)PCR 方法成功地擴增出7 株PA 分離菌的ETA 基因序列，電泳均可見長約2 000 bp 的特異條帶，其大小與預計的相吻合（見圖3）。

圖3 銅綠假單胞菌ETA 基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 3 The electrophoresis result of PCR product of ETA protein gene of PA

測序結(jié)果經(jīng)拼接、驗證得到7 株PA 分離菌成熟的ETA 結(jié)構(gòu)蛋白基因：PA-47 株ETA 結(jié)構(gòu)蛋白基因長1 824 bp，編碼608 個氨基酸；其余6 株分離菌均為1 839 bp，編碼613 個氨基酸。

2.3 ETA 蛋白基因遺傳進化分析結(jié)果

2.3.1 ETA 蛋白基因序列分析結(jié)果 7 株PA 分離菌的ETA 基因之間核苷酸和氨基酸同源性分別 為99.0% ～100.0%，99.0% ～100.0%， 其 中PA-47 株與PA-49 株的核苷酸和氨基酸同源性均最高，為100.0%；PA-1 與PA-4 株之間氨基酸同源性最高，為100.0%。與27 株PA 參考菌株之間核苷酸和氨基酸同源性分別為98.9%～100.0%，98.5%～100.0%。序列分析結(jié)果表明，7 株PA 分離菌成熟的ETA 結(jié)構(gòu)蛋白基因共有多處堿基位點發(fā)生了變異，其中包括PA-47 株第106-110 位15 個堿基的連續(xù)缺失和10 處錯義突變（見表2）。

表2 銅綠假單胞菌ETA 基因核苷酸突變比較結(jié)果Table 2 Comparison of nucleotide mutations of PA ETA gene

氨基酸序列分析表明，PA-1 和PA-4 株的ETA 氨基酸變異位點（T179A、N364S、V407I、S515G）與NCTC10299 株完全相同；PA-47 株的氨基酸變異位點（33-37 位連續(xù)缺失、T179A、N364S、S515G） 與AR458、A681 和PAAK088 株完 全 相 同；PA-49 株（T37P、T179A、N364S、S515G）與SE5416 和NCTC10728 株 完 全 相 同；PA-2 株 存 在N364S 和S515G 變 異；PA-34 存 在T179A、N364S、P373S 和S515G 變 異；PA-18 存在N231T、P232R、N364S、S515G、K590Q 和P608S 變異（見表3）。此外，7 株PA 分離菌第426 位(H)、第440 位(H)、第470 位(Y)、第481 位(Y)、第553 位(E)和第558 位(W)氨基酸殘基均未發(fā)生突變。

表3 銅綠假單胞菌ETA 氨基酸殘基比較結(jié)果Table 3 Comparison of ETA amino acid residues of PA

2.3.2 ETA 蛋白基因遺傳進化分析結(jié)果 遺傳進化分析結(jié)果表明，34 株PA ETA 基因可分成2 個群（Ⅰ～Ⅱ），除P49 London 株位于Ⅱ群外，7株PA 分離菌與其余26 株參考菌株均位于Ⅰ群。PA-47、PA-49 株 與AR458、A681、PAAK088、NCTC10728、PA99、SE5416、DVT779 株均位于第1 大分支；PA-1、PA-4 株與NCTC10299、PAG5、SE5443、PABCH13 株均位于第4 大分支；PA-34、PA-2、PA-18 株分別位于第2、3、5 大分支（見圖4）。

圖4 銅綠假單胞菌ETA 基因遺傳發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree of PA ETA gene based on its encoded amino acid sequences

3 結(jié)論與討論

近年來，關于從發(fā)病動物分離的銅綠假單胞菌報道越來越多，該細菌組織嗜性廣泛、致病力較強，給動物健康養(yǎng)殖和人類健康均帶來了巨大威脅。16S rRNA 基因擴增與序列分析結(jié)果證實，從河北省及周邊地區(qū)雞場水樣和病料純化的7 株細菌分離物均為PA。高 GC 模板形成的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)可阻抑DNA 聚合酶在模板上的推進，此類模板上可能存在的多個非特異性引物局部復性位點會產(chǎn)生非特異性擴增［13］，這就使PCR 過程中用普通DNA 聚合酶從高GC 模板中擴增長片段 DNA 序列較困難。鑒于銅綠假單胞菌基因組GC 含量較高［14］，由 toxA 基因編碼的ETA 基因長度大于1 500 bp，故本研究對7 株ETA 蛋白基因進行PCR 擴增時選用了Tks Gflex DNA Polymerase。

研究表明，第426 位組氨酸［15］、第553 位谷氨酸及558 位色氨酸［16-17］對于ETA Ⅲ區(qū)的ADPRT 活性是必須的。其他研究［18-21］證實，第440 位組氨酸、470 位和481 位酪氨酸對ETA 的酶活性及細胞毒性是重要的。本研究結(jié)果表明，7 株PA 分離菌ETA 酶活區(qū)上述位點的氨基酸均未發(fā)生突變，這與李雅林等［22］報道結(jié)果一致。值得注意的是，來自雞場的PA-18 株分離菌ETA Ⅲ區(qū)氨基酸存在S515G、K590Q 和P608S 突變，這3 個位點的突變與從膿胸病人痰液中分離的PA-SD 株均完全一致［22］。第590 位由堿性氨基酸變成了酸性氨基酸，這種變化很可能改變ETA 蛋白的α 螺旋，從而改變其功能。Claude 等［4］和李雅林等［22］曾先后報道，第515 位氨基酸突變（S515G）與銅綠假單胞菌膿胸分離株的ADPRT 活性減少密切相關。與標準產(chǎn)毒菌PA103 株相比，本研究中7 株PA 分離菌酶活區(qū)氨基酸序列均存在S515G 突變，該突變是否與PA 的ADPRT 活性有關？此外，雞場分離的PA-18 株的P608S 突變與ETA 的致病特性之間的關系如何？以上問題值得進一步深入研究。

本研究遺傳進化分析結(jié)果顯示，自遼寧大連地區(qū)某雞場分離的PA-49 株ETA 基因與河北石家莊地區(qū)分離的PA-47 株遺傳距離較近，與河北衡水、保定、滄州和邯鄲地區(qū)分離的其他5 株PA 分離菌遺傳距離較遠，ETA 基因遺傳進化是否與地域相關？這些問題尚需進一步研究。

河北及周邊地區(qū)雞場鑒定的7 株PA 分離菌成熟的ETA 結(jié)構(gòu)蛋白基因多處堿基位點發(fā)生變異，包括PA-47 株第106-110 位15 個堿基的連續(xù)缺失和10處錯義突變；其ETA 蛋白共有6 種不同的氨基酸變異位點模式；第426 位(H)、第440 位(H)、第470位(Y)、第481 位(Y)、第553 位(E)和第558 位(W)氨基酸殘基均未發(fā)生突變，均為有毒形式。