酵母酶解物對HUVEC細胞氧化損傷的保護機制

黃滟波 孫為正 侯軼 孫江文 劉光毅 胡松青?

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.華南理工大學 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.華南理工大學醫(yī)院，廣東 廣州 510640；4.中新國際聯(lián)合研究院，廣東 廣州 510555)

活性氧是組織、細胞的基本成分，在細胞信號與穩(wěn)態(tài)方面有重要的作用[1]。過量的活性氧會引起細胞內(nèi)大分子的氧化損傷，進而造成生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、各種酶失活、加速脂肪氧化和誘導DNA復制表達錯誤等問題，導致機體細胞和組織器官的各種損傷，引發(fā)一系列慢性疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病等[2]。食物是抗氧化劑的重要來源，世界衛(wèi)生組織(WHO)一直主張在世界范圍內(nèi)增加飲食中的抗氧化劑[3]。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是天然抗氧化活性物質(zhì)的重要來源。Oh等[4]報道紫貽貝的糜蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強的體外抗氧化活性，細胞實驗顯示其可以減少人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)細胞氧化損傷模型中活性氧(ROS)的生成，提高細胞的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)等物質(zhì)的抗氧化能力，同時可以通過下調(diào)caspase- 3、p53等蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平減少內(nèi)皮細胞的凋亡。

本課題組在前期研究中利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)粗酶制劑酶解食用酵母獲得了酵母酶解物(YH)，并通過動物實驗發(fā)現(xiàn)YH具有較強的降血壓活性[5]。YH主要成分為多肽(占67.32%)，另外存在少量糖(16.84%)、水分(6.80%)及核酸(0.44%)。從YH中鑒定得到了778個多肽序列，其中91%以上多肽相對分子質(zhì)量小于1500。另外，YH中含有較多的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，推測其可能具有一定的抗氧化活性。由于氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮功能障礙在高血壓的病理生理中起著重要作用，血管內(nèi)皮細胞能產(chǎn)生的ROS包括超氧陰離子、H2O2、NO、過氧硝酸鹽及羥自由基等，可通過不同的途徑影響血管內(nèi)皮功能[6]。許多具有降血壓活性的藥物或天然產(chǎn)物同時也具有較強的抗氧化活性[7- 9]。因此，本研究分析了YH的抗氧化活性，探討其對H2O2引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，可為YH在抗氧化功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用酵母粉，購自廣東省五洲制藥有限公司；谷胱甘肽(GSH)，購自廣州健陽生物科技有限公司；鄰苯三酚，購自上海潤捷化學試劑有限公司；1，1-二苯基- 2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma公司生產(chǎn)；H2O2(30%，體積分數(shù))，購自國藥集團化學試劑有限公司；達爾伯克改良伊格爾(DMEM)細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗、胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)，美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、臺盼藍，購自北京索萊寶科技有限公司；細胞培養(yǎng)瓶、無菌離心管，美國Corning公司生產(chǎn)；SOD、丙二醛(MDA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；人臍靜脈細胞融合細胞系(EA.hy 926)，購自中國科學院上海細胞庫；原代HUVEC細胞、內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液及內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，購自奧賽爾斯生物技術(shù)(上海)有限公司。

YH按參考文獻[10]所述方法制備。以芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)粗酶對食用酵母進行水解，水解產(chǎn)物離心棄去沉淀，上清液噴霧干燥后制得YH。經(jīng)測定其主要成分為多肽和還原糖[5]。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC- 1304IIA2型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；SHELLAB2406型CO2培養(yǎng)箱，美國希爾頓制造股份有限公司生產(chǎn)；Axio vert型顯微鏡，德國Zeiss公司生產(chǎn)；5804R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；DW-HL678型超低溫冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司生產(chǎn)；Synergy Neo2型酶標儀，美國BioTek公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性測定參考文獻[11]的方法進行。樣品組：取100 μL樣品與100 μL 0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)1 h后，利用酶標儀測定517 nm處的吸光值(Dm)；對照組以等量的去離子水代替樣品溶液，反應(yīng)后測517 nm處的吸光值(Dn)；背景組：取100 μL樣品與100 μL無水乙醇，室溫避光1 h后，利用酶標儀測定517 nm處的吸光值(Dx)。按式(1)計算DPPH自由基清除率(S)。

S=[1-(Dm-Dx/Dn)]×100%

(1)

1.3.2 超氧陰離子清除活性

以鄰苯三酚法測定樣品的超氧陰離子清除活性[12]。取13 μL一定質(zhì)量濃度的樣品溶液和174 μL的Tris-HCl緩沖液(pH=8.2，0.5 mol/L)混合均勻后加入96孔板，25 ℃保溫10 min。然后加入13 μL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L，10 mmol/L HCl)迅速搖勻后，在酶標儀上每隔30 s測定一次321 nm處的吸光值，總測定時間為150 s，計算線性范圍內(nèi)吸光度的增加，以蒸餾水代替樣品溶液為對照組。按照式(2)計算超氧陰離子清除活性：

A=(1-Vs/Vc)×100%

(2)

式中，Vc為對照組鄰苯三酚自氧化速率；Vs為樣品組鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.3 還原力測定

還原力的測定參考Benjakul等[13]的方法。樣品溶于0.2 mol/L的PBS 緩沖液。向試管中依次加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL)的樣品以及1 mL 1%的鐵氰化鉀。之后于50 ℃水浴20 min，加入2 mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)。5 min后，再加入1.25 mL 0.1%的三氯化鐵，混合均勻，靜置30 min，測量反應(yīng)液在700 nm處的吸光度值。以0.2 mol/L的PBS(pH=6.6)代替樣品為空白對照，用GSH為陽性對照。

1.3.4 YH對氧化損傷細胞增殖的影響

EA.hy 926細胞培養(yǎng)液組成為90%DMEM培養(yǎng)液(添加NaHCO31.5 g/L，pH=7.0)、10%胎牛血清及1% 青霉素/鏈霉素雙抗。

采用MTT法測定細胞增殖情況[14]。取對數(shù)期細胞消化后以1.0×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔接入100 μL，邊緣孔及未用孔以無菌PBS緩沖液填充。放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入以無血清培養(yǎng)液配制的不同濃度樣品培養(yǎng)24 h，吸棄細胞培養(yǎng)液。然后在體系中加入200 μL H2O2濃度為250 μmol/L的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，之后于24 h和48 h時每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中液體，加入150 μL DMSO輕微震蕩10 min，用酶標儀測定570 nm 處的吸光值。以無細胞培養(yǎng)液，加入等量MTT相同處理作為調(diào)零孔。細胞存活率通過實驗組吸光值除以對照組吸光值計算。實驗分組如下。

空白對照組：無血清培養(yǎng)液代替樣品溶液，不添加H2O2。損傷對照組：無血清培養(yǎng)液代替樣品溶液，H2O2濃度為250 μmol/L。損傷+YH低劑量組：YH 250 μg/mL，H2O2250 μmol/L。損傷+YH高劑量組：YH 500 μg/mL，H2O2250 μmol/L。陽性對照組：GSH 1.63 μmol/L，H2O2250 μmol/L。

1.3.5 YH對細胞SOD和MDA的影響

取對數(shù)期細胞消化后以1.0×105個/mL的密度接種于6孔板，每孔接入1 mL，每個實驗組4個復孔。培養(yǎng)24 h待細胞長滿孔底90%以上時，吸棄原培養(yǎng)液，按分組加入以無血清培養(yǎng)液配制的樣品繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄細胞培養(yǎng)液。然后在體系中加入1 mL H2O2濃度為250 μmol/L的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后棄去細胞培養(yǎng)液，以胰酶消化細胞，離心后棄去上清液，再用4 ℃預冷的PBS重懸細胞并離心，重復兩次，收集細胞并通過液氮反復凍融使細胞破碎。離心收集破碎后細胞進行SOD和MDA的測定。

細胞內(nèi)總蛋白含量以BCA法試劑盒進行檢測，細胞內(nèi)SOD以試劑盒進行檢測，細胞內(nèi)MDA以硫代巴比妥酸(TBA)法試劑盒進行檢測。

1.3.6 轉(zhuǎn)錄組學研究

由于EA.hy 926是HUVEC細胞與A549肺癌細胞融合的永生化細胞系，含有A549細胞基因。因此，轉(zhuǎn)錄組學研究采用原代HUVEC細胞為實驗模型。實驗分為2組：空白對照組(3個生物學平行分別命名為CTRL1、CTRL2、CTRL3)和YH組(300 μg/mL，3個生物學平行分別命名為YH1、YH2、YH3)。樣品均以無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液溶解，過0.22 μm濾膜除菌，每個實驗組設(shè)置3個生物學平行。對數(shù)期細胞以1.0×105個/mL的密度均勻接種至T 25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，接種量4 mL。待培養(yǎng)至細胞長滿底部80%以上時，吸棄原培養(yǎng)液換以4 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使細胞生長同步化。之后棄去培養(yǎng)液，加入4 mL含待測樣品的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，對照組加入4 mL無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后結(jié)束培養(yǎng)。之后棄去培養(yǎng)液，用PBS小心清洗細胞后加1 mL TRIzol試劑裂解細胞反復吹打至液體澄清透明，液氮速凍保存，送上海美吉生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組學測序分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)利用SPSS statistics進行統(tǒng)計分析，以單因素方差分析方法進行差異比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 YH的抗氧化活性

YH的DPPH清除活性結(jié)果見圖1所示。隨著YH濃度升高，DPPH自由基清除活性逐漸提高。在0.5～2.0 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率與YH濃度有劑量效應(yīng)。當YH濃度繼續(xù)增大，自由基清除率增長趨于平緩，通過曲線擬合計算測定其半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為1.85 mg/mL。Ahn等[15]將三文魚加工后的副產(chǎn)品利用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等進行水解，水解產(chǎn)物對 DPPH 清除的EC50值在1.63～4.95 mg/mL之間。Picot等[16]研究發(fā)現(xiàn)魚蛋白水解物對DPPH清除的EC50值為24.7 mg/mL。大麥醇溶蛋白的堿性蛋白酶水解物EC50在0.5～3.8 mg/mL范圍內(nèi)[17]。與這些研究相比，YH具有一定的DPPH清除活性。

圖1 YH的DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH free radical scavenging activity of YH

鄰苯三酚自氧化法測定YH的超氧陰離子清除活性結(jié)果如圖2所示。在5～25 mg/mL范圍內(nèi)，超氧陰離子清除活性隨著YH濃度升高逐漸提高，其EC50為20.27 mg/mL，表明YH具有一定的超氧陰離子清除能力。YH還原力的測定結(jié)果如圖3所示。在測定范圍內(nèi)，YH的還原力隨濃度升高而增加，線性關(guān)系良好。當D(700)=0.5時，YH質(zhì)量濃度為4.87 mg/mL，GSH質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，YH的還原力是GSH的0.03倍，表明YH的還原能力相對較弱。

圖2 YH的超氧陰離子清除活性Fig.2 Superoxide anion scavenging activity of YH

(a)YH

(b)GSH圖3 還原力測定結(jié)果Fig.3 Results of reducing power assay

2.2 YH對氧化損傷EA.hy 926細胞增殖的影響

在細胞培養(yǎng)液中先加入不同濃度的YH，培養(yǎng)細胞24 h，以未添加YH的細胞為陰性對照。之后再加入H2O2培養(yǎng)24 h以誘導細胞產(chǎn)生氧化損傷，并通過MTT法測定細胞的存活率，以陰性對照組存活率為100%計算。結(jié)果顯示，250 μmol/L的H2O2處理可以顯著抑制EA.hy 926細胞的增殖，損傷模型組的細胞存活率為陰性對照組的(47.80±4.62)%。低、高劑量的YH處理后EA.hy 926細胞的存活率分別為對照組的(46.23±6.36)%和(57.92±8.10)%。低劑量的YH處理細胞后，細胞存活率與模型組相比無顯著差異(P>0.05)。而高劑量的YH對細胞氧化損傷的保護作用極顯著(P<0.01)。許多蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物或多肽都被證實對血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷具有保護作用[9，18- 19]。文獻報道多肽FWKWP和GIEWA可以將H2O2誘導的HUVEC存活率由51.66%分別提升至(64.74±2.02)% 及(63.99±3.78)%，其作用機制可能是通過促進細胞內(nèi)SOD活性、清除細胞內(nèi)活性氧等途徑實現(xiàn)的[20]。因此，本研究進一步測定了YH對細胞內(nèi)氧化指標的影響，以揭示其對血管內(nèi)皮氧化損傷的保護機制。

2.3 YH對EA.hy 926細胞內(nèi)MDA和SOD的影響

生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，最終產(chǎn)物為MDA，能引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細胞毒性[21]。MDA的含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要指標，也能間接反映細胞的過氧化損傷程度。同時，生物體中存在許多抗氧化酶或者有抗氧化作用的化合物如SOD、GSH等，組成了復雜的保護體系，以對抗氧化損傷、維持機體的氧化平衡[22]。通過測定細胞內(nèi)MDA和SOD的值，可以反映細胞所處的氧化狀態(tài)，揭示YH對氧化損傷細胞的保護機制。

YH對EA.hy 926細胞內(nèi)MDA、SOD的影響如圖4所示。與對照組相比，H2O2處理的氧化損傷模型細胞內(nèi)MDA含量由(3.05±0.65)μmol/mg(每毫克蛋白質(zhì))升高至(10.99±1.13)μmol/mg。高劑量YH對細胞內(nèi)MDA的生成有一定程度抑制作用，測定值為(8.05±0.66)μmol/mg(P<0.01)。與對照組相比，H2O2處理的氧化損傷模型細胞內(nèi)SOD酶活大幅下降，由(43.66±2.76)U/mg(每毫克蛋白質(zhì))降至(23.44±2.14)U/mg，表示H2O2對EA.hy 926造成的氧化損傷能極顯著降低細胞內(nèi)的SOD酶活(P<0.01)。當利用不同劑量的YH對氧化損傷的EA.hy 926細胞進行預處理后，細胞內(nèi)的SOD酶活有了不同程度的變化。陽性對照組GSH可以提升細胞內(nèi)SOD活性，達(34.83±1.90)U/mg。低劑量YH對氧化損傷細胞內(nèi)SOD活性無顯著影響(P>0.05)，高劑量YH則能夠提升SOD活性至(30.55±1.38)U/mg。Cai等[20]報道，五肽FPYLRH在100 μg/mL濃度條件下可以極顯著地增加H2O2誘導氧化損傷HUVEC細胞的存活率。該五肽可在增加HUVEC細胞中SOD的活力同時，減低MDA的生成量。由以上結(jié)果可以看到，YH具有較強的體外抗氧化活性，并能通過抑制MDA生成、提升細胞內(nèi)SOD活性等途徑增強血管內(nèi)皮細胞抵抗氧化損傷的能力。

**表示與損傷模型組相比差異極顯著(P<0.01)圖4 YH對氧化損傷EA.hy 926細胞內(nèi)MDA和SOD的影響Fig.4 Effects of YH on MDA and SOD of H2O2-induced EA.hy 926 injury model

2.4 YH對HUVEC細胞抗氧化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

YH組與對照組相比，差異表達基因的情況見圖5。圖中每個點代表一個特定的基因，橫縱坐標的數(shù)值都做了對數(shù)化處理。縱坐標-lgP越大則表達差異越顯著，橫坐標中FC表示表達量差異倍數(shù)。在左邊的點為表達差異下調(diào)的基因，右邊的點為表達差異上調(diào)的基因，越靠近兩邊和上邊的點表達差異越顯著。YH組共有577個基因與對照組相比差異顯著(P<0.05)，其中上調(diào)445個，下調(diào)132個。值得注意的是，與對照組相比YH組細胞的與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因如SOD2和HMOX1等轉(zhuǎn)錄水平變化顯著。圖6中以基因轉(zhuǎn)錄本TPM值，即每百萬讀段中來自于該轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù)，表示該基因轉(zhuǎn)錄水平。YH組SOD2基因(ENSG00000285441)轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)至對照組的2.88倍，該基因編碼的超氧化物歧化酶2(SOD2)是細胞內(nèi)線粒體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有清除活性氧的作用[23]。文獻[24]報道，蝦青素可以通過上調(diào)SOD2抑制血管衰老。金環(huán)蛇抗菌肽(BF- 30)可通過上調(diào)細胞內(nèi)SOD2等抗氧化酶的表達量從而顯著改善由H2O2誘導的腎小管上皮細胞(HK- 2)氧化損傷[25]。YH組細胞HMOX1基因(ENSG00000100292)與對照組相比，其mRNA表達量上調(diào)2.07倍(見圖6)。HMOX1基因編碼的血紅素加氧酶1(HO- 1)是體內(nèi)重要的保護蛋白，可降解細胞內(nèi)過多的游離血紅素，被稱為人體抵御氧化攻擊的第一道防線，該基因的上調(diào)被證實有改善內(nèi)皮細胞功能的作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可保護小鼠肝細胞(AML12)并抵抗H2O2引起的氧化損傷，其機制為通過上調(diào)HO- 1等抗氧化酶基因的表達從而降低細胞ROS水平[27]。貝萊斯芽孢桿菌中分離得到的具有抗菌活性和抗氧化活性的多肽MS15，可減少小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)中的ROS產(chǎn)生，并通過促進HO- 1的表達來提高SOD等抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄速率[28]。大米來源的商品肽Oryza P60預處理肝癌細胞(HepG2)可極顯著上調(diào)細胞中HO- 1的表達水平，并抵抗由H2O2或?qū)σ阴０被?APAP)引起的細胞毒性[29]。以上結(jié)果可知，YH可通過顯著上調(diào)細胞SOD- 2和HO- 1等抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)在細胞模型中的抗氧化活性。YH主要由大量的小分子多肽組成，從中分離、鑒定出有較強抗氧化的多肽，將是本課題下一階段的研究重點。

圖中紅色點為顯著上調(diào)基因，綠色點為顯著下調(diào)基因，灰色點為非顯著差異基因圖5 YH組與對照組相比差異表達基因火山圖Fig.5 Volcano plots of differential expressed genes of YH group with the control group

圖6 HUVEC細胞中SOD2和HMOX1基因mRNA的表達量Fig.6 mRNA expression of SOD2 and HMOX1 genes in HUVEC

3 結(jié)論

YH具有體外抗氧化活性，其對DPPH自由基清除的EC50值為1.85 mg/mL。高劑量的YH對由H2O2造成的EA.hy 926細胞增殖活性降低有極顯著改善作用(P<0.01)。YH可通過上調(diào)HUVEC細胞中與抗氧化活性相關(guān)的基因SOD2和HMOX1 mRNA表達量的作用機制，減少細胞內(nèi)MDA生成，顯著促進SOD的生成，實現(xiàn)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護活性。YH有望用于降血壓或抗氧化相關(guān)的功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。