殼聚糖修飾甜菜紅素脂質(zhì)體的制備與抗腫瘤活性

趙振剛 劉爽 游麗君

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

甜菜紅色素為一類水溶性含氮色素，甜菜苷是甜菜紅素的主要成分，其中還包括前甜菜苷和異甜菜苷等成分[1- 2]。甜菜紅素易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。甜菜紅素具有多種生物活性，如抗氧化[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]和降血糖[6]等生物活性，但甜菜紅素在外部條件影響下容易發(fā)生降解，如酶、高溫、光照、pH和氧氣[7]等條件。此外，由于其低脂溶性，難以通過細(xì)胞膜被細(xì)胞吸收，因此甜菜紅素的生物利用度較低，不利于口服吸收[8]。為克服這兩大缺點(diǎn)，采用脂質(zhì)體對甜菜紅素包埋，可提高甜菜紅素的穩(wěn)定性和生物利用度[9]。

脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的雙分子層膜的球形小泡，既可包載水溶性物質(zhì)，亦可包載油溶性物質(zhì)。其中水溶性物質(zhì)位于脂質(zhì)體的內(nèi)部核心，油溶性物質(zhì)嵌于磷脂雙分子層中[10]。傳統(tǒng)脂質(zhì)體在儲存和加工過程中仍存在諸多問題，如傳統(tǒng)脂質(zhì)體容易發(fā)生聚集、融合；脂類成分的氧化水解導(dǎo)致藥物泄露[11]。針對這些問題，對脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[12- 13]。殼聚糖是一種天然線性陽離子多糖，溶于酸性溶液中，具有較好的生物相容性、可降解性、低毒性和粘膜粘附性[14]，可通過靜電相互作用和氫鍵與脂質(zhì)體結(jié)合[15]。殼聚糖修飾可增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，保護(hù)脂類成分在外部刺激下不被降解[16]；還可增加脂質(zhì)體的緩釋效果，從而增加被包載物質(zhì)的活性[17]。Mazloomi等[18]采用0.2 %的殼聚糖修飾脂質(zhì)體，殼聚糖修飾的脂質(zhì)體相比于傳統(tǒng)脂質(zhì)體顯示出更好的緩釋效果、包封率和穩(wěn)定性。Hao等[19]采用殼聚糖修飾包埋槲皮素的納米脂質(zhì)體，其抗氧化性和儲存穩(wěn)定性相比于游離的槲皮素都有較大提升。然而，殼聚糖與納米脂質(zhì)體的修飾結(jié)合在天然色素中的應(yīng)用較少，其對甜菜紅素生物活性的影響尚不清楚。這方面的研究不僅可以改善甜菜紅素的穩(wěn)定性，還有望通過提升甜菜紅素的細(xì)胞親和力進(jìn)而提高甜菜紅素的生物活性，擴(kuò)大甜菜紅素的應(yīng)用范圍。

本研究以殼聚糖作為修飾劑修飾脂質(zhì)體，構(gòu)建包埋甜菜紅素的藥物輸送體系。以包封率為指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定制備甜菜紅素納米脂質(zhì)體的最佳工藝條件。采用不同濃度的殼聚糖修飾甜菜紅素納米脂質(zhì)體并測定脂質(zhì)體的粒徑、多分散指數(shù)(PDI)和Zeta電位，用以評價甜菜紅素、甜菜紅素納米脂質(zhì)體(NLP)和殼聚糖修飾的脂質(zhì)體(CH-NLP)對HepG2細(xì)胞的抗增殖活性和細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

甜菜紅素(糊精稀釋)，上海瑞楚生物科技有限公司生產(chǎn)；大豆卵磷脂(純度>90%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；膽固醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；透析袋(7000 u)，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；HepG2細(xì)胞，源自廣州中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。高糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、青霉素和鏈霉素溶液，美國Gbico公司生產(chǎn)；胎牛血清，浙江天航生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道夫公司生產(chǎn)；超聲細(xì)胞破碎JYⅡN，寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn)；Zetasizer Nano ZSE，英國馬爾文儀器有限公司生產(chǎn)；核酸蛋白分析儀，美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甜菜紅素納米脂質(zhì)體的制備

參考吳琦[20]的方法，采用逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體。將大豆卵磷脂溶于9 mL乙醚中，甜菜紅素溶于pH 6.8 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶液中，向乙醚溶液中加入3 mL甜菜紅素溶液，短時冰浴超聲處理。超聲功率為330 W，開1 s，關(guān)1 s，形成穩(wěn)定的油包水(W/O)乳液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉乙醚，當(dāng)達(dá)到膠態(tài)后加入適量的含有吐溫80的PBS溶液水合半小時，水合后的混懸液再一次短時冰浴超聲處理以縮小脂質(zhì)體粒徑?；鞈乙簝Υ嬖? ℃冰箱中備用。

1.3.2 包封率及載藥率的計算

參考童桂鴻[21]的方法測定脂質(zhì)體的包封率和載藥率，并進(jìn)行簡單的修改。取適量脂質(zhì)體混懸液置于透析袋中，封口，按照1：100(透析內(nèi)液：透析外液)的比例用pH 6.8 0.05 mol/L的PBS溶液透析，溫和攪拌，每2 h換一次透析外液，直至透析外液變?yōu)闊o色。分別取透析后和透析前的脂質(zhì)體混懸液加入10% Trolox-100溶液，溶解脂質(zhì)。在538 nm下測定吸光度，計算甜菜紅素的濃度，包封率(EE)和載藥率(DL)的計算公式如下：

EE=m1/m2×100%

(1)

DL=m1/mt×100%

(2)

式中，m1為透析液中甜菜紅素質(zhì)量，m2為脂質(zhì)體原液中甜菜紅素質(zhì)量，mt為加入的總脂質(zhì)量。

稱取10 mg的甜菜紅素，用PBS(pH=6.8，0.05 mol/L)溶液溶解并稀釋至5～50 μg/mL甜菜紅素溶液，以PBS溶液作為空白，在538 nm下測定吸光值得到的甜菜紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：

y=0.015 9x+0.014 3，r2=0.999 7。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

考察單一因素對甜菜紅素包封率的影響。在其他條件不變的情況下，選擇超聲處理時間(2、4、6、8、10 min)、卵磷脂質(zhì)量濃度(20、30、40、50、60 mg/mL)、卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比即卵膽比(2：1、4：1、6：1、8：1、10：1)、甜菜紅素與卵磷脂質(zhì)量比即藥脂比(1：6、1：12、1：18、1：24、1：30)進(jìn)行研究。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以包封率為響應(yīng)值，選出對甜菜紅素包封率影響較大的3個因素，即卵磷脂質(zhì)量濃度(A)、藥脂比(B)、卵膽比(C)，采用三因素三水平，按L9(34)設(shè)計正交試驗(yàn)，確定制備脂質(zhì)體的最佳工藝條件，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。同時用最優(yōu)條件制備傳統(tǒng)脂質(zhì)體用于制備殼聚糖修飾的脂質(zhì)體和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將2 g殼聚糖溶解在1%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸溶液中，過夜攪拌，并稀釋成不同濃度的殼聚糖溶液。將納米脂質(zhì)體按照1：1(體積比)的比例逐滴加入到殼聚糖溶液中，以500 r/min攪拌1 h，靜置0.5 h保證殼聚糖與脂質(zhì)體充分結(jié)合。再在 3 000g4 ℃ 條件下離心30 min以除去多余的未與脂質(zhì)體結(jié)合的殼聚糖。棄掉上清液，加入PBS重懸，得到的溶液放入4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 粒徑、PDI和Zeta電位的測定

取一定量的NLP和CH-NLP用去離子水稀釋20倍。在25 ℃下采用Zetasizer Nano ZS型納米粒度儀測定粒徑、PDI和電位，折射指數(shù)為(1.420±0.001)，每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3.7 細(xì)胞毒性

根據(jù)Zheng等[22]報道的方法測定脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，代數(shù)為12～30代。高糖DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液。細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的加濕二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。癌細(xì)胞以2.5×104/孔的密度接種到96孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育12 h。之后棄掉培養(yǎng)基，加入不同濃度的用培養(yǎng)基稀釋的脂質(zhì)體溶液，空白孔為不含藥物的培養(yǎng)基溶液。藥物處理24 h，24 h后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入50 μL亞甲基藍(lán)染液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，使得活細(xì)胞被亞甲基藍(lán)充分染色。除去亞甲基藍(lán)染液，每孔加入100 μL洗脫緩沖液(49% PBS，50%乙醇，1%乙酸)，振蕩混合均勻。在570 nm下測定每孔的吸光度。細(xì)胞毒性按照式(3)計算：

C=(Dc-Ds)/Dc×100%

(3)

其中，Dc為空白組的吸光度，Ds為加藥組的吸光度。

1.3.8 抗增殖活性

石蠟包埋的肝組織蠟塊，切成5 μm厚。經(jīng)二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，蘇木精染色，鹽酸乙醇水化流水沖洗，1%伊紅酒精溶液染色，蒸餾水稍洗，再經(jīng)過脫水和透明后。中性樹膠封片，進(jìn)行圖像采集和分析。

根據(jù)Wen等[23]報道的方法測定脂質(zhì)體的抗增殖活性。癌細(xì)胞以1.5×104/孔的密度接種到96孔板中，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，待細(xì)胞完全貼壁后，棄掉培養(yǎng)基。加入不同濃度的用培養(yǎng)基稀釋的脂質(zhì)體溶液，空白孔為不含藥物的培養(yǎng)基溶液，藥物處理72 h。棄掉培養(yǎng)基，再按照細(xì)胞毒性方法采用亞甲基藍(lán)法染色。將96孔板置于酶標(biāo)儀中，在570 nm下測定每孔的吸光度。細(xì)胞存活率為

V=Dc/Ds×100%

(4)

其中，Dc為空白組的吸光度，Ds為加藥組的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0軟件繪圖，用Calcusyn計算EC50和CC50，采用SPSS 22.0的ANVOA分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。CC50為細(xì)胞毒性的半抑制濃度。EC50為細(xì)胞存活率的半數(shù)效應(yīng)濃度。CC50/EC50為藥物的選擇指數(shù)(SI)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲處理時間對甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率的影響

如圖1所示，隨著超聲時間的增加，甜菜紅素脂質(zhì)體的包封率先增后減。在超聲時間為8 min時，包封率達(dá)到最大。超聲時間較短時，不利于形成油包水的乳液；超聲時間較長時，存在破乳的風(fēng)險，甜菜紅素會從內(nèi)水相泄露，降低包封率。因此選擇8 min為最佳超聲時間。

不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)圖1 超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.1 Effect of ultrasound time on the encapsulation efficiency of the liposome

2.1.2 卵磷脂濃度對甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率的影響

如圖2所示，卵磷脂用量對脂質(zhì)體包封率有一定的影響。隨著卵磷脂濃度的增加，包封率不斷增加。當(dāng)卵磷脂質(zhì)量濃度超過50 mg/mL時，包封率的變化不再明顯。卵磷脂用量增加，載藥量上升，因此包封率明顯增加。但當(dāng)卵磷脂濃度過高時，脂質(zhì)體混懸液過于黏稠，引起脂質(zhì)體的聚集，甚至出現(xiàn)少量沉淀。因此選擇50 mg/mL為卵磷脂的最佳質(zhì)量濃度。

不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)圖2 卵磷脂質(zhì)量濃度對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effect of soybean lecithin mass concentration on the encapsulation efficiency of the liposome

2.1.3 卵膽比對甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率的影響

如圖3所示，隨著膽固醇用量的減少，包封率不斷減少。膽固醇可以嵌入到脂質(zhì)膜中調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的剛性和穩(wěn)定脂質(zhì)雙分子膜，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，增加脂質(zhì)體的包封率。但過量的膽固醇會破壞脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，使藥物滲出，降低包封率。因此選擇2：1為最佳的卵膽比。

不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)圖3 卵膽比對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.3 Effect of the ratio of soybean lecithin content to cholesterol content on the encapsulation efficiency of the liposome

2.1.4 藥脂比對甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率的影響

如圖4所示，藥脂比對包封率是有一定影響的。隨著卵磷脂用量的增加，包封率先增加后減小。在藥脂比達(dá)到1：18時，包封率達(dá)到最大，之后小幅降低。當(dāng)卵磷脂用量增加，可包封的甜菜紅素的量隨著增高。因此選擇1：18作為最佳藥脂比。

不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)圖4 藥脂比對脂質(zhì)體包封率的影響Fig.4 Effect of the ratio of betanin content to soybean lecithin content on the encapsulation efficiency of the liposome

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

以卵磷脂質(zhì)量濃度(A)、藥脂比(B)、卵膽比(C)為自變量，包封率為因變量，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，并采用極差分析對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。按L9(34)設(shè)計正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。表中D表示空列。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental design and results

由極差分析結(jié)果可以看出，3個因素對甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率影響的主次順序?yàn)槁涯懕取⒙蚜字|(zhì)量濃度、藥脂比。比較各因素的K值，確定最佳條件為C3A3B2，即卵磷脂質(zhì)量濃度60 mg/mL，藥脂比1：18，卵膽比6：1。驗(yàn)證最佳條件，得到甜菜紅素納米脂質(zhì)體的包封率為(42.67±1.67)%，載藥量為(2.63±0.42)%。證明該工藝穩(wěn)定可行。

2.3 殼聚糖修飾的甜菜紅素納米脂質(zhì)體的制備

采用0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、10.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，余同)的殼聚糖溶液修飾甜菜紅素納米脂質(zhì)體。平均粒徑、PDI和電位如表2所示。由正交試驗(yàn)所得的最佳條件制備得到的甜菜紅素納米脂質(zhì)體平均粒徑為(156.40±2.88)nm，PDI為(0.27±0.01)，Zeta電位為(-19.50±0.52)mV。隨著殼聚糖含量的增加，脂質(zhì)體的粒徑逐漸增加，PDI小幅增加；這是因?yàn)闅ぞ厶桥c脂質(zhì)體通過靜電相互作用結(jié)合，殼聚糖包裹在脂質(zhì)體表面，從而增加了殼聚糖的粒徑。脂質(zhì)體的Zeta電位由負(fù)變正，顯示殼聚糖與脂質(zhì)體成功結(jié)合。隨著殼聚糖濃度的增加，脂質(zhì)體的Zeta電位在殼聚糖含量為0.60%時達(dá)到最大值，之后隨著殼聚糖含量的增加略微減小，脂質(zhì)體表面的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和。因此選擇殼聚糖含量為0.60%進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)際上，殼聚糖與脂質(zhì)體的結(jié)合除存在靜電相互作用之外，還存在疏水相互作用，疏水相互作用的存在促進(jìn)了殼聚糖在脂質(zhì)體膜上的物理吸附和沉積[24]。

表2 殼聚糖濃度與平均粒徑、PDI和Zeta電位的關(guān)系Table 2 Relationship among chitosan concentration and ave-rage size，PDI and Zeta potential

2.4 脂質(zhì)體抗增殖活性評價

甜菜紅素、甜菜紅素納米脂質(zhì)體(NLP)和殼聚糖修飾的脂質(zhì)體(CH-NLP)對HepG2細(xì)胞的毒性和抗增殖作用如圖5所示。從圖中可以看出，甜菜紅素、NLP和CH-NLP對HepG2細(xì)胞都具有抗增殖作用，并且都具有一定的細(xì)胞毒性。甜菜紅素、NLP和CH-NLP對HepG2細(xì)胞的EC50、CC50和SI值見表3。CH-NLP呈現(xiàn)最低的EC50值，為(69.46±1.75)μg/mL，對HepG2細(xì)胞的抑制效果最好。CH-NLP和NLP的SI值均大于2，說明CH-NLP和NLP對HepG2細(xì)胞的抑制作用是由其抗增殖活性而不是細(xì)胞毒性引起的[25]。甜菜紅素對HepG2細(xì)胞展現(xiàn)出最弱的抑制作用。在甜菜紅素質(zhì)量濃度達(dá)2 000 μg/mL時，其細(xì)胞增值抑制率為40.65%，毒性僅為15.46%，這可能是因?yàn)樘鸩思t素易溶于水，具有較低的親脂性，難以通過細(xì)胞膜被細(xì)胞吸收[26]。NLP和CH-NLP的抗增殖活性和細(xì)胞毒性相比于游離的甜菜紅素都大幅提高，是因?yàn)橹|(zhì)體載藥體系可提高甜菜紅素與細(xì)胞膜的親和力，更有利于細(xì)胞對甜菜紅素的吸收[8]。CH-NLP的抗增殖活性優(yōu)于NLP，主要是因?yàn)闅ぞ厶峭繉拥拇嬖谔岣吡酥|(zhì)體的細(xì)胞親和力，由于殼聚糖修飾的脂質(zhì)體帶正電荷，增加了帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜對藥物的吸收[27]。

(a)甜菜紅素

(b)NLP

(c)CH-NLP圖5 甜菜紅素、NLP和CH-NLP對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗增殖活性Fig.5 Cytotoxicity and antiproliferative effects of betanin，NLP and CH-NLP against HepG2 cells

表3 甜菜紅素、NLP和CH-NLP對HepG2細(xì)胞的EC50、CC50和SI值Table 3 EC50，CC50 and SI values of betanin，NLP and CH-NLP against HepG2 cells

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)確定了制備甜菜紅素納米脂質(zhì)體的最佳工藝條件，即卵磷脂質(zhì)量濃度60 mg/mL，藥脂比1：18，卵膽比6：1。最終得到的甜菜紅素納米脂質(zhì)體包封率為(42.67±1.67)%，載藥量為(2.63±0.42)%，平均粒徑為(156.40±2.88) nm，PDI為(0.27±0.01)，Zeta電位為(-19.50±0.52) mV。修飾脂質(zhì)體的最佳殼聚糖含量為0.60%。得到的殼聚糖修飾的甜菜紅素納米脂質(zhì)體平均粒徑為(194.60±4.43) nm，PDI為(0.29±0.05)，Zeta電位為(5.80±0.79) mV。CH-NLP和NLP對HepG2細(xì)胞都有明顯的增殖抑制作用，其EC50值分別為(69.46±1.75)和(108.75±2.31) μg/mL；NLP的CC50大于400 μg/mL，CH-NLP的CC50大于240 μg/mL，兩者SI值都大于2。甜菜紅素對HepG2細(xì)胞的抑制能力最弱，可能是由于其低脂溶性難以被細(xì)胞吸收。脂質(zhì)體載藥體系極大地提高了甜菜紅素的抗增殖活性，同時殼聚糖的修飾也提高了脂質(zhì)體的細(xì)胞親和力，使得帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜更容易吸收帶正電荷的甜菜紅素納米脂質(zhì)體。本研究的結(jié)果可為甜菜紅素的開發(fā)利用提供新的方向。