氧化苦參堿對皮膚創(chuàng)面愈合中PCNA、α-SMA及Type Ⅰ collagen的影響

劉俊梅,劉彥紅，李 娟，戴貴東，鄭 萍

氧化苦參堿(OMT)是寧夏苦豆子中單體化合物，是一種具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿，分子式為C15H24N2O2。相關(guān)文獻(xiàn)表明，氧化苦參堿具有多種藥理作用，如抗血管、抗心律失常、抗腫瘤、殺菌、抗炎等[1-4]。創(chuàng)面愈合過程中，多種炎癥因子及細(xì)胞修復(fù)共同參與其中，而氧化苦參堿對其是否具有作用，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本實驗旨在以小鼠背部全層皮膚缺損為實驗?zāi)Ｐ停瑧?yīng)用氧化苦參堿進(jìn)行干預(yù)，探討其對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響及可能機(jī)制，為臨床創(chuàng)面愈合提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：清潔級♂昆明種小鼠，體重(22±2)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(寧)2009-0003。

1.2 藥品與試劑：氧化苦參堿購自寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司，純度：99.8%，批號：P0100226；戊巴比妥鈉和多聚甲醛購自Sigma公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)檢測試劑盒和血清增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)檢測試劑盒購自ImmunoWay公司；細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)檢測試劑盒購自abcam公司；實驗用水為超純水。

1.3 主要儀器:PMZ000型病理圖像分析系統(tǒng)(德國LEICA公司)；MIAS2000病理圖像分析軟件(川大智勝軟件公司)；Rm2015型切片機(jī)(德國LEICA公司)；數(shù)碼相機(jī)(日本尼康公司)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠皮膚創(chuàng)面制備及實驗動物分組：1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，背部去毛，暴露皮膚，用2%碘酒和75%酒精依次消毒后，背部正中剪除全層皮膚，制備1.5 cm×1.5 cm正方形傷口，創(chuàng)面自然干燥，止血。制備創(chuàng)面后，24只♂小鼠隨機(jī)分為4組：創(chuàng)面對照組，氧化苦參堿低、中、高劑量組(20、40、80 mg/kg)，除創(chuàng)面對照組給予等體積生理鹽水外，其余各組分別按20、40和80 mg/kg給予氧化苦參堿灌胃，每天1次，共14 d。實驗第3、5、7、9、11、14 d，每組分別取6只小鼠稱重，戊巴比妥鈉過量麻醉處死。

1.4.2 小鼠皮膚創(chuàng)面觀察：①觀察指標(biāo)：每天觀察并記錄小鼠毛色、攝食、飲水及活動情況，包括創(chuàng)面色澤、質(zhì)地、有無滲液、是否感染、水腫、肉芽組織生長情況等。在1、3、5、7、9、11、14 d時麻醉小鼠，描繪未愈合皮膚創(chuàng)面。②描繪創(chuàng)面面積:將描繪的創(chuàng)面區(qū)域均勻涂黑，采用清華紫光A900掃描儀及美國Image-Pro PlusVersion6.0(IPP)圖像分析軟件分析并計算各組小鼠未愈合創(chuàng)面面積，與原創(chuàng)面面積比較，評價創(chuàng)面愈合情況。③小鼠皮膚創(chuàng)面組織的Van Gieson染色：實驗第 3、5、7、9、11和14 d 時，從創(chuàng)面組織正中線處剪開，取左側(cè)一半創(chuàng)面組織及周邊正常皮膚，10%多聚甲醛內(nèi)固定24 h后，用流水沖洗3 h，然后梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片。酸性復(fù)紅和苦味酸以1∶9比例混合，配成VG染色液染色30 s，用分化液分化4 s后脫水，透明，用中性樹膠封片。載玻片置于400倍光學(xué)顯微鏡下,觀察小鼠皮膚創(chuàng)面處膠原纖維生長情況并采圖。

1.5 小鼠皮膚創(chuàng)面組織中PCNA、α-SMA和Type Ⅰ collagen的免疫組織化學(xué)方法檢測：石蠟切片脫蠟、梯度乙醇脫水后，對組織進(jìn)行高壓熱抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS沖洗3次，2 min/次(檢測α-SMA的切片不修復(fù))。3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，置于室溫孵育20 min，甩去液體，PBS沖洗3次，2 min/次，滴加一抗，室溫孵育1.5～2 h(PCNA Polyclonal Antibody (YT3617)1∶400、α-SMA Polyclonal Antibody(YT5053)1∶1000、Anti-CollagenⅠantibody (ab34710)1∶800。PBS沖洗3次，2 min/次；除去PBS溶液后滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，2 min/次；除去PBS溶液后，將新配置的DAB顯色工作液滴于載玻片上，顯微鏡下觀察2～8 min；自來水終止反應(yīng)；切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的外觀觀察：小鼠皮膚創(chuàng)面隨時間逐漸被新生肉芽組織填充，上皮覆蓋，部分毛發(fā)生成。第1 d，各組小鼠皮膚創(chuàng)面邊緣收縮，創(chuàng)面無感染。第3、5 d，創(chuàng)面對照組創(chuàng)面較干燥，分泌物較少，創(chuàng)面有肉芽組織充填，肉芽較粗大；氧化苦參堿各組創(chuàng)口周圍毛發(fā)明顯生長，創(chuàng)面較為濕潤，肉芽組織色澤紅潤、肉芽略顯細(xì)小，生長良好。第7、9 d，各組創(chuàng)面已形成瘢痕，觸之較硬，結(jié)痂易碎。第11 d，各組小鼠皮膚創(chuàng)面微小，已無結(jié)痂覆蓋。第14 d，各組小鼠皮膚創(chuàng)面基本愈合。

2.2 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面未愈合面積的影響：描繪小鼠皮膚未愈合創(chuàng)面面積結(jié)果顯示，各組小鼠皮膚創(chuàng)面描繪面積隨時間推移不斷縮小，直至創(chuàng)面愈合。與創(chuàng)面對照組相比，氧化苦參堿20 mg/kg組在第5 d，氧化苦參堿40 mg/kg組在第7、11 d 時小鼠未愈合面積顯著減小(P<0.05)；其余各時間點，氧化苦參堿組與創(chuàng)面對照組小鼠創(chuàng)面未愈合面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面未愈合面積的影響

2.3 氧化苦參堿對小鼠皮膚創(chuàng)面組織VG染色的影響:傷后第11 d，創(chuàng)面對照組的創(chuàng)面幾乎被肉芽組織充填，皮膚創(chuàng)面中纖維細(xì)胞呈細(xì)長梭狀，排列紊亂，膠原纖維增生不明顯；氧化苦參堿各給藥組創(chuàng)面幾乎完全被肉芽組織充填，且成纖維細(xì)胞減少，纖維細(xì)胞明顯增多，肉芽組織新生膠原纖維排列整齊。鏡下可觀察到陽性細(xì)胞在近創(chuàng)緣組織、創(chuàng)面基底部、新生的肉芽組織和表皮細(xì)胞中逐漸增加表達(dá)，但維持水平及時間各實驗組存在差異。氧化苦參堿20 mg/kg組創(chuàng)面中α-SMA第3 d 最低，之后開始上升，在愈合中、后期表達(dá)量大幅度增加，到第9、11 d 時達(dá)最高峰。氧化苦參堿40、80 mg/kg組中α-SMA的表達(dá)呈現(xiàn)較平穩(wěn)趨勢。氧化苦參堿40 mg/kg組Type Ⅰ collagen表達(dá)在第3 d 時最低(P<0.05)，到第5 d 時達(dá)高峰，之后下降再上升，呈波浪形表達(dá)。氧化苦參堿80 mg/kg組Type Ⅰ collagen第3 d 最低(P<0.05)，之后開始迅速上升，到第7 d 時表達(dá)顯著性升高(P<0.05)，之后逐漸下降，見表2。

表2 小鼠皮膚創(chuàng)面組織中PCNA、α-SMA、Type Ⅰ collagen含量組織學(xué)評分結(jié)果(分，

3 討論

在皮膚創(chuàng)面形成早期，機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活，較多中性粒細(xì)胞浸潤，隨后出現(xiàn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤[5]。入侵微生物被炎癥細(xì)胞吞噬，并通過炎癥細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和生長因子促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。研究結(jié)果顯示，氧化苦參堿使小鼠創(chuàng)面愈合過程的中、后期未愈合創(chuàng)面面積顯著減?。籚an Gieson染色結(jié)果顯示，氧化苦參堿組創(chuàng)面被新生表皮覆蓋，新生纖維膠原與表皮平行生長，呈現(xiàn)有序排列，較創(chuàng)面對照組肉芽組織填充更快，新生毛細(xì)血管增多，促進(jìn)創(chuàng)面早期修復(fù)[6-7]，以給藥第9 d及第11 d效果最為明顯。提示氧化苦參堿可促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合。

PCNA是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[8-9]。靜止的細(xì)胞PCNA幾乎不表達(dá)。皮膚組織中的PCNA主要定位于表皮基底層細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，在皮膚組織的發(fā)生與修復(fù)過程中PCNA表達(dá)增強(qiáng)[10]。研究表明，通過YAG 激光及強(qiáng)脈沖光激光多次刺激小鼠皮膚，增強(qiáng)了PCNA 表達(dá)，使皮膚細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，促進(jìn)皮膚結(jié)構(gòu)重建，達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果[11]。本實驗研究結(jié)果顯示，在愈合過程中，氧化苦參堿(20、40、80 mg/kg)組在7 d 時PCNA 表達(dá)高于創(chuàng)面對照組，對小鼠創(chuàng)面組織細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。提示在小鼠創(chuàng)面愈合過程中、后期，氧化苦參堿使PCNA表達(dá)顯著增加。

α-SMA是一種異常的纖維細(xì)胞-肌纖維母細(xì)胞，與創(chuàng)面收縮關(guān)系密切[12-13]。目前認(rèn)為，α-SMA 的表達(dá)使肌成纖維細(xì)胞的收縮能力增加，使肉芽組織纖維化，促進(jìn)結(jié)締組織的形成[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA 在創(chuàng)面形成初期3 d 時開始表達(dá)。氧化苦參堿(20 mg/kg)組的α-SMA隨時間表達(dá)量逐漸增加，到創(chuàng)面愈合中、后期α-SMA表達(dá)量較高，而未愈合創(chuàng)面面積明顯減小。提示氧化苦參堿促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合與α-SMA表達(dá)有關(guān)。

成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合過程中的主要細(xì)胞，成纖維細(xì)胞合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其中包括Type Ⅰ collagen，細(xì)胞依附其生長。當(dāng)成纖維細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生明顯改變，Type Ⅰ collagen分泌減少，從而影響創(chuàng)面愈合[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面對照組的VG染色顯示新生纖維膠原的增加主要見于真皮全層，可見分布均勻、排列稀疏、呈波浪樣、紅色深染膠原纖維束，而氧化苦參堿各組小鼠損傷部位皮膚膠原纖維染色略深，成熟膠原增加，但以淺層變化較為明顯。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，小鼠皮膚創(chuàng)傷后，Ⅰ型膠原纖維在創(chuàng)傷愈合早、中期排列較為紊亂；愈合后期第7、9 d時Ⅰ型膠原纖維排列較為規(guī)律；組織學(xué)評分結(jié)果顯示，氧化苦參堿各給藥組Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)在愈合過程各時間點的整體水平高于創(chuàng)面對照組，各組呈現(xiàn)由低到峰值再下降的趨勢。提示氧化苦參堿可增加小鼠皮膚創(chuàng)面中Ⅰ型膠原纖維的表達(dá)。

綜上所述，氧化苦參堿能增加皮膚創(chuàng)面的愈合中PCNA、α-SMA及Type Ⅰ collagen的表達(dá)。由于創(chuàng)面愈合過程復(fù)雜，影響因素眾多，氧化苦參堿對創(chuàng)面愈合的影響是否通過其他作用靶點，還需要進(jìn)一步研究。